一种评价药物和保健食品乌发功效的方法与流程

本发明涉及药物和保健食品功效评价领域，尤其涉及一种评价药物和保健食品乌发功效的方法。

背景技术：

1、头发脱色是指头发内黑色素积累减少，头皮头发的生长周期约为3.5年，在经过10个自然生长周期后，黑色素细胞活性开始减弱，导致毛发着色减少，由黑色转变为灰色或白色，这是最常见的一种头发脱色原因，即自然衰老的过程。另一种头发脱色的原因是偶然因素，包括家族特殊的基因序列、早衰类疾病、精神压力、饮食营养等，均可能造成在机体正常衰老之前发生头发脱色，过早出现白发临床上称为白发病。即使不伴随任何其它病理症状，白发也会给人带来巨大困扰。毛发从毛囊长出，毛发通过毛囊从身体吸收养分，从而支持毛发的生长。人的毛囊位于真皮层，生长期的毛囊可深达皮下组织。蓝光作为可见光中能量最大的光线，尽管其能量略小于紫外线，但蓝光的穿透性强于紫外线，其可以穿透表皮层到达真皮层，造成真皮层损伤，因此在导致皮肤光老化方面，蓝光的危险性并不弱于紫外线。根据以上的发病因素，改善白发可从以下几点着手：1.抗氧化抗衰老，已有研究表明，年龄增加、紫外线或蓝光照射、黑素细胞形成黑色素的过程中都在产生ros，线粒体dna缺失是氧化应激的标志，其在灰白头发中的含量高于正常发色，该过程对应的中医病机是肝肾不足和气血亏虚；2.缓解精神压力，心理紧张状态可促发剧烈持久的神经内分泌紊乱，导致体内儿茶酚胺分泌增加。儿茶酚胺中的肾上腺素和去甲肾上腺素作用于肾上腺素受体，使末梢血管收缩导致微循环障碍，去甲肾上腺素加强褪黑素的合成，出现白发，该过程对应的中医病机是血热上行和情志郁结；3.均衡营养，身体缺少蛋白质、植物油、b族维生素、金属元素(如铜、锌、钴、铁等)，亦会导致白发的发生，该过程对应的中医病机是气血亏虚。

2、目前，研究乌发功效的实验手段比较单一。人体乌发相关的研究仅局限于一些白发的原因分析和少量治疗的个案报道，如公开号为cn112587434a的发明专利“乌发素、乌发素的制备方法及洗护液”中通过使用乌发素的志愿者第6个月和第10个月测试志愿者的白发率评价乌发素的乌发功效，耗时长且由于个体差异结果波动大。而动物实验通常为将鼠脱毛，灌胃给药21天后剪下皮片，测量毛发长度、重量。有研究表明白色昆明雌性小鼠及白色雌性豚鼠不适宜用作观测皮肤表皮及毛囊黑色素或变化情况的实验研究；小黑鼠适宜用作色素代谢障碍性皮肤疾病的实验动物，但仅适宜用于观测毛囊变化情况的实验研究。棕黄色豚鼠则适宜用做观察皮肤表皮及毛囊的黑色素或变化情况的实验研究，但实际情况中用棕黄色豚鼠开展相关研究非常少。可以说，目前筛选乌发功效的实验方法具有周期长、成本高、效率低的诸多劣势，很难满足当今社会人们对乌发的需求。

技术实现思路

1、本发明首先为了克服现有技术下筛选乌发功效的实验方法具有周期长、成本高、效率低的问题，提供一种评价药物和保健食品乌发功效的方法，该方法可快速、高效地实现对药物和保健食品乌发功效的定量评价。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种评价药物和保健食品乌发功效的方法，包括如下步骤：

4、s1、增加黑色素功效评价：使用苯基硫脲建立斑马鱼的黑色素抑制模型，水溶给予模型斑马鱼待测药品或保健食品1-3天后检测斑马鱼头部黑色素含量；

5、s2、改善血液循环功效评价：使用蓝光照射建立斑马鱼的循环障碍模型，模型斑马鱼培养1-3天后水溶给予待测药品或保健食品1-3天，检测斑马鱼循环血管面积、循环血管数量和血流速度；

6、s3、抗氧化功效评价：使用蓝光照射建立斑马鱼的氧化应激模型，模型斑马鱼培养1-3天后水溶给予待测药品或保健食品1-3天，检测斑马鱼体内ros水平。

7、本发明分别构建了斑马鱼的黑色素抑制模型、循环障碍模型和氧化应激模型来评价待测药品和保健食品的乌发功效。本发明使用斑马鱼进行乌发功效测试，斑马鱼是脊椎动物，与人基因相似度高达87％。斑马鱼皮肤结构与功效与人类高度相似，含有表皮层及基底膜区、真皮层和皮下组织，并且斑马鱼皮肤间质结缔组织、胶原及其临近的纤维母细胞及皮肤基因表达也与人类皮肤相似。斑马鱼体内的色素有黑色素、黄色素和银色素三种，非常适合研究黑色素细胞的增殖分化和黑色素的胞内合成。camp依赖的信号通路、mapks信号通路以及wnt/β-catenin信号通路在斑马鱼上高度保守。同时，斑马鱼模型可以评价抗氧化、抗衰老、改善血液循环功效，是一个能够全面评价乌发功效的动物模型，且具有实验周期短、成本低、效率高的优点。

8、作为优选，所述s1中斑马鱼的黑色素抑制模型的建立步骤为：水溶给予1dpf的野生型ab品系斑马鱼苯基硫脲1-2天，苯基硫脲的给药浓度为100-300μmol/l。

9、苯基硫脲(ptu)对斑马鱼安全，并且对斑马鱼黑色素的抑制性能稳定。

10、作为优选，所述s1中；斑马鱼头部黑色素的检测方法为：将斑马鱼在显微镜下拍照，分析斑马鱼头部黑色素信号强度；

11、黑色素蛋白含量的检测方法为：提取斑马鱼头部的蛋白后使用酶标仪检测黑色素蛋白的活性。

12、作为优选，所述s1还包括在水溶给予模型斑马鱼待测样品1-3天后检测头部黑色素形成基因mitfa、tyr和tyrp1b的表达量，头部黑色素形成基因的表达量的检测方法为：使用rna快速提取试剂盒提取各实验组斑马鱼总rna，测定总rna浓度和纯度，再通过q-pcr检测β-actin、和头部黑色素形成基因基因的表达，用β-actin作为基因表达的内参，计算头部黑色素形成基因的相对表达量。

13、头部黑色素蛋白含量以及头部黑色素形成基因表达量也可体现斑马鱼体内黑色素水平。mitfa是黑色素细胞诱导转录因子，与人基因mitf同源，参与昼夜节律、黑色素细胞分化和转录。mitfa是发育过程中黑色素细胞分化所必须的，其活性在转录和翻译后水平上均受调节，调控黑色素形成功能，色素沉着基因仅在表达mitfa的细胞亚群中表达，mitfa是在黑色素母细胞前体中表达的早期基因之一，也称黑色素母细胞标志基因。mitfa置于产生黑色素和最终分化黑色素细胞所必需的多个基因的上游，包括tyr(酪氨酸酶)、tyrp2(酪氨酸酶相关蛋白2)、trp1(酪氨酸酶相关蛋白1)和kita等，这些酶对黑色素体中黑色素的产生至关重要。tyr，酪氨酸酶，与人基因tyr同源，参与黑色素合成的主要基因之一，参与酪氨酸的多巴胺生物合成过程、虹膜分化和黑色素体组织，用于研究色盲和眼皮肤白化病。黑色素细胞形成后，黑色素合成由黑色素生成酶调节，黑色素生成酶含有三种主要蛋白质：tyr、tyrp1和tyrp2，黑素生成过程是由苯丙氨酸羟化成l-酪氨酸或直接由l-酪氨酸开始，然后羟化成l-二羟基苯丙氨酸(l-dopa)，l-dopa进一步氧化为l-dopaquinone(dq)，这两种反应都是由酪氨酸酶催化的，因此酪氨酸酶是黑素形成的关键限速酶。研究表明，5-ht诱导神经嵴细胞的黑色素母细胞分化和再生，可能通过上调黑色素生成主调节因子mitfa和限速酶tyr的表达来促进黑色素生成。tyrp1b，酪氨酸酶相关蛋白1b，与人基因tyrp1同源，分化黑色素细胞的标志基因之一，参与黑色素细胞分化、黑色素体组织和视网膜色素上皮发育。与眼皮肤白化病、眼皮肤白化病iii.型和色素沉着疾病相关。酪氨酸酶是黑色素合成所需的酶，并且在黑色素细胞或黑色素细胞中特异性表达。

14、作为优选，所述s2中斑马鱼的循环障碍模型的建立步骤为：将1-3dpf的转基因血管荧光fli-1品系斑马鱼破除卵膜后用蓝光照射；

15、s3中斑马鱼的氧化应激模型的建立步骤为：将1-3dpf的野生型ab品系斑马鱼破除卵膜后用用蓝光照射。

16、本发明使用蓝光照射损伤斑马鱼循环系统并引起氧化应激。

17、作为优选，所述s2和s3中蓝光照射的照射强度为110-130mw/cm2；单次连续照射时间大于7h，累计照射时长为10-22h。

18、作为优选，所述s2和s3中当蓝光照射的照射距离小于5cm时，控制环境温度为20±3℃。

19、作为优选，所述s2中检测斑马鱼循环血管面积、循环血管数量和血流速度为检测斑马鱼的肠下血管面积、肠下血管数量和血流速度。

20、肠下血管属于循环血管中的一部分，在检测观察时循环血管中肠下血管部分较为清晰受干扰小，且其变化可反映循环血管整体变化情况。

21、作为优选，所述s3中通过使用cm-h2dcfda试剂孵育斑马鱼检测斑马鱼体内ros水平。

22、作为优选，所述方法中，待测药物或保健食品具有增加黑色素功效、改善血液循环功效、抗氧化功效中任意二种功效时判定待测药物或保健食品具有乌发功效。

23、由于白发是多种原因导致的，当待测药品或保健食品在黑色素增加、改善循环障碍和抗氧化3项功能中至少满足2项，可判定为具有乌发功效。

24、因此，本发明具有如下有益效果：通过构建斑马鱼的黑色素抑制模型、循环障碍模型和氧化应激模型来量化评价待测药品和保健食品的黑色素增加、改善循环障碍和抗氧化效果，进而综合评价待测药品和保健食品的乌发功效，评价所需周期短、成本低、效率高。