一种真菌毒素的光电化学检测方法

本发明涉及一种真菌毒素的检测方法，具体涉及一种基于包封氧化亚铜的金属有机框架(mof)构建的光电化学传感器用于真菌毒素的检测方法，属于光电化学生物分析领域。

背景技术：

1、赭曲霉毒素是曲霉属和青霉属真菌产生的次级代谢物。其中，赭曲霉毒素a(ochratoxin a，ota)毒性强、分布广、对人类健康危害极大(2b类致癌物)，存在于豆类、玉米、小麦、葡萄酒、咖啡豆等常见农产品中。ota具有较高的热稳定性和化学稳定性，极易在人体内积蓄，产生严重的毒害作用。

2、近年来，报道的许多分析方法已成功用于赫曲霉毒素a定量分析，mohammad等人利用超高效液相色谱与荧光检测(uhplc-fld)对咖啡样本中的黄曲霉素b1、b2、g1、g2四种物质的污染程度进行了检测，结果表明四种物质分离良好(al-ghouti m a,alhusaini a,abu-dieyeh m h,et al.determination of aflatoxins in coffee by means of ultra-high performance liquid chromatography-fluorescence detector andfungiisolation[j].international journal of environmental analyticalchemistry,2022,102(18):6999-7014.)。hplc具有高通量、高选择性、分离速度快等特点，但此法检测时间长、检测成本高、无法对大批量样品进行快速检测的缺点，在实际应用中仍有一定的局限性。

3、herrero等人首次通过quechers法对植物性饮料进行分析，建立了一种超高效液相色谱串联质谱法，实现了对大豆、燕麦和水稻植物性饮料中11种真菌毒素的同时检测(miro-abella e,herrero p,canela n,et al.determination of mycotoxins in plant-based beverages using quechers and liquid chromatography-tandem massspectrometry[j].food chemistry,2017,229:366-372.)。lc-ms可以对多种真菌毒素进行同时检测，准确度和灵敏度较高，但该方法操作复杂、所用仪器昂贵、检测成本较高，在一定程度上限制了其应用。与这些方法相比，基于光电化学的生物传感平台具有检测限低、灵敏度高、特异性好等明显的优势，可实现ota的灵敏检测。但是目前为止，还未见利用cu2o@zif-8用于构建的光电化学传感器用于赭曲霉毒素的相关报道。

技术实现思路

1、为克服现有技术的不足与缺陷，本发明的目的是在于提供一种通过光电化学检测真菌毒素的方法，该方法采用包封氧化亚铜的zn金属有机框架(cu2o@zif-8)复合材来产生光电流信号，同时利用包裹葡萄糖氧化酶(gox)的真菌毒素目标响应性dna水凝胶氧化葡萄糖产生葡萄糖酸，并基于葡萄糖酸能够使得cu2o@zif-8裂解而使其光电流信号下降的特点，构建生物传感器，从而实现对真菌毒素的高灵敏度、高选择性光电化学检测。

2、为了实现上述技术目的，本发明提供了一种真菌毒素的光电化学检测方法，该方法包含以下步骤：

3、1)将cu2o@zif-8纳米复合物分散至溶剂中后，滴加至电极表面，经过干燥得到复合电极；所述复合电极进行光电检测，得到光电流响应值i；所述cu2o@zif-8纳米复合物由金属有机框架zif-8包裹cu2o纳米颗粒构成；

4、2)将真菌毒素溶液加入至包裹葡萄糖氧化酶的dna水凝胶中进行孵育i，再加入葡萄糖溶液进行孵育ii，得到反应液；将所述反应液滴加到所述复合电极上进行孵育iii后，进行光电检测，得到光电流响应值ii；所述dna水凝胶由接枝dna链1的聚丙烯酰胺与接枝dna链2的聚丙烯酰胺通过真菌毒素适体的特异性结合反应得到；

5、3)将一系列不同浓度的真菌毒素溶液按照步骤2)进行操作，得到一系列光电流响应值ii，并构建真菌毒素溶液浓度与光电流响应值ii和光电流响应值i的差值之间的标准曲线；

6、4)将待测真菌毒素溶液按步骤2)进行操作，得到相应光电流响应值，并根据标准曲线计算待测真菌毒素溶液的浓度。

7、本发明的真菌毒素的光电化学检测方法关键是在于利用cu2o@zif-8纳米复合物来产生光电信号，cu2o@zif-8纳米复合物由金属有机框架zif-8包裹cu2o纳米颗粒构成，zif-8与cu2o纳米颗粒之间的协同作用有效促进了载流子的迁移和空穴的产生，从而使其表现出强的光电流信号响应，相对单独的cu2o纳米颗粒光生载流子迁移率有大幅度提升，并且zif-8的包裹作用克服了cu2o纳米颗粒容易受到光腐蚀的缺陷，大大提高了cu2o纳米颗粒的稳定性。特别是cu2o@zif-8纳米复合物能够在葡萄糖酸作用下裂解，使其光电信号下降，本发明基于此构建真菌毒素的光电化学传感器。本发明通过在聚丙烯酰胺链中引入dna序列，该dna序列能与真菌毒素适配体进行特异性结合，从而可以利用真菌毒素适配体与dna序列之间的特异性结合将聚丙烯酰胺链交联形成具有三维网络结构的dna水凝胶，同时，在交联过程中引入gox，实现gox原位嵌入或包裹在dna水凝胶内部，该dna水凝胶具有适体响应，当dna水凝胶所处环境中存在真菌毒素时，真菌毒素与dna水凝胶中结合的真菌毒素适配体产生特异性反应，从而导致dna水凝胶裂解，释放其内部的gox，并且环境中的gox浓度越高，dna水凝胶裂解程度越高，相应释放的gox越多，两者呈现正比关系，而利用水凝胶中释放出的gox来催化葡萄糖氧化产生葡萄糖酸，再将葡萄糖酸转移到cu2o@zif-8复合材料上孵育反应，使zif-8裂解导致其光电流信号下降，从而构建了真菌毒素浓度与光电流信号大小之间的关系，从而通过测量光电流信号的前后变化即可实现对真菌毒素的灵敏检测。

8、作为一个优选的方案，所述cu2o@zif-8纳米复合物通过以下方法制备得到：将cu2o纳米颗粒分散至溶剂中，再加入锌盐溶液与2-甲基咪唑溶液搅拌反应，即得cu2o@zif-8纳米复合物。通过在cu2o nps表面包覆zif-8合成光电流信号更强，且稳定性更好的cu2o@zif-8复合材料。

9、作为一个优选的方案，所述反应的条件为：在保护气氛下，于45～55℃温度下，反应0.5～1.5h。

10、本发明在cu2o纳米颗粒表面通过配位反应原位组装zif-8，基于cu2o纳米颗粒为菱形十二面体，与zif-8空腔形貌一致，且cu2o分子的大小和zif-8的空腔直径非常匹配，cu2o能成功包裹在zif-8中，而单独的cu2o纳米颗粒的光生载流子迁移率较低，且容易受到光腐蚀，而zif-8不仅可以保护cu2o纳米颗粒不被光腐蚀，增强其稳定性，而且能够与cu2o纳米颗粒之间的协同作用也有效促进了载流子的迁移和空穴的产生，从而表现出强的光电流信号响应。

11、作为一个优选的方案，所述cu2o纳米颗粒与锌盐及2-甲基咪唑的摩尔比为1:(4～5):(6～7)。在优选的比例范围内，生成的zif-8能够将cu2o纳米颗粒完全包裹，如果cu2o纳米颗粒比例过高，则部分cu2o纳米颗粒不能被zif-8原位包裹，而cu2o纳米颗粒比例过低，则部分zif-8没有作用于cu2o纳米颗粒。

12、作为一个优选的方案，所述cu2o纳米颗粒通过以下方法制备得到：将铜盐和表面活性剂溶于水中，再加入氢氧化钠溶液和盐酸羟胺溶液进行沉淀反应，即得。

13、作为一个优选的方案，所述沉淀反应的条件为：在超声作用下，于室温下反应0.5～1.5h。在优选的反应条件下合成的cu2o为菱形十二面体与zif-8的形貌一致，且cu2o分子的大小和zif-8的空腔直径非常匹配，cu2o能成功包裹在zif-8中。

14、作为一个优选的方案，所述包裹gox的dna水凝胶通过以下方法制备得到：将包含修饰丙烯酰胺的dna链1(s-a)及丙烯酰胺的溶液与包含修饰丙烯酰胺的dna链2(s-b)及丙烯酰胺的溶液混合后，依次加入过硫酸铵和四甲基乙二胺、葡萄糖氧化酶及真菌毒素适体，进行反应，即得。四甲基乙二胺作为促进过硫酸铵产生自由基的促进剂，有利于低温下的聚合反应。通过自由基聚合可以将dna链1和dna链2均匀引入聚丙烯酰胺，而dna链1和dna链2可以与真菌毒素适体特异性结合，从而交联形成凝胶。真菌适体以赭曲霉毒素a适体为例，修饰丙烯酰胺的dna链1(s-a)的序列为：5’-acrydite-ttt gat tca cag atg agt-3’。修饰丙烯酰胺的dna链2(s-b)的序列为：5’-acrydite-ttt agg tgt gac gga tga-3’。所述赭曲霉毒素a(ota)适体的序列为：5’-gat cgg gtg tgg gtg gcg taaagg gag cat cgg aca-3’

15、作为一个优选的方案，所述反应的条件为：在20～30℃，反应15～25min。作为一个优选的方案，所述孵育i的条件为：在20～30℃，孵育0.5～1.5h。

16、作为一个优选的方案，所述孵育ii的条件为：在20～30℃，孵育20～40min。

17、作为一个优选的方案，所述孵育iii的条件为：在20～30℃，孵育10～30min。

18、本发明的cu2o纳米颗粒的制备方法：将5ml cucl2溶液(0.1m)和sds(0.87g)加入69.2ml去离子水中，在32～34℃下搅拌至sds溶解，超声分散5min。然后向混合溶液中加入naoh溶液(1.8ml 1.0m)和nh2oh·hcl溶液(24ml 0.1m)，超声1h，离心收集黄色沉淀，再用水和乙醇体积比为1:1的混合溶液洗涤两次。

19、本发明的cu2o@zif-8的制备方法：将制备好的cu2o nps与pvp(1g)分散在20ml甲醇中，超声5min之后，依次加入20ml含有zn(no3)2·6h2o(0.7g)和pvp(0.25g)的甲醇溶液和另一等量的含2-甲基咪唑(0.26g)和pvp(0.25g)的甲醇溶液，在氩气氛围下50℃搅拌混合物1h。反应完成后离心收集沉淀，用甲醇溶液洗涤3次，放于60℃真空烘箱中干燥12h，得到cu2o@zif-8。

20、本发明的包裹gox的dna水凝胶的制备方法：是用包含200mm nacl、1mm edta和4％丙烯酰胺的10mm tris-hcl缓冲溶液分别制备10μm s-a(带有丙烯酰胺基的dna链-a)和s-b(带有丙烯酰胺基的dna链-b)得到储备溶液之后，将含有10μl s-a和10μl s-b的溶液a用氮气鼓泡5min以除去空气。另外，将0.002g aps和2μltemed加入到20μl去离子水中得到新鲜制备的溶液b。将2μl溶液b加入到溶液a中后，用氮气鼓泡5min。接着将10μl葡萄糖氧化酶(10μg/ml)添加到上述混合液中，氮气鼓泡5min。加入10μl真菌毒素适体(10μm)后，在25℃下反应20min，期间a链、b链与真菌毒素适体交联，最终得到负载gox的dna水凝胶。

21、本发明的光电检测过程中，在配备有500w氙灯的chi760e电化学工作站进行pec测量，采用传统三电极体系，gce为工作电极，铂丝为辅助电极，ag/agcl为参比电极。测试电解液为na2so4(25ml 0.1m)溶液，测定电位为0.1v。

22、本发明技术方案的检测原理为：利用真菌毒素适体构建dna水凝胶，真菌毒素适体作为dna水凝胶支架的一部分，而gox包封在dna水凝胶中，当真菌毒素存在时，真菌毒素适体与真菌毒素特异性结合使得dna水凝胶破裂，从而被包裹的gox从水凝胶中释放出来，并催化葡萄糖产生大量葡萄糖酸，再将葡萄糖酸转移到cu2o@zif-8复合材料上孵育反应，使zif-8裂解暴露cu2o使其光电流信号下降，最终通过测量光电流信号的前后变化即可实现对真菌毒素的灵敏检测。

23、本发明提出的一种基于包封氧化亚铜的金属有机框架(mof)构建的光电化学传感器用于真菌毒素的检测方法，包含以下步骤：

24、(1)包裹gox的dna水凝胶的制备：用包含200mm nacl、1mm edta和4％丙烯酰胺的10mm tris-hcl缓冲溶液分别制备10μm s-a和s-b储备溶液。之后将含有10μl s-a和10μls-b的溶液a用氮气鼓泡5min以除去空气。另外，将0.002g aps和2μl temed加入到20μl去离子水中得到新鲜制备的溶液b。将2μl溶液b加入到溶液a中后，用氮气鼓泡5min。接着将10μl葡萄糖氧化酶(10μg/ml)添加到上述混合液中，氮气鼓泡5min。加入10μl真菌毒素适体(10μm)后，在25℃下反应20min，期间a链、b链与真菌毒素适体交联，最终得到负载gox的dna水凝胶。

25、(2)光电化学传感器的制备：碳电极(gce)打磨后，在去离子水和乙醇中交替超声处理，用n2吹干备用。将cu2o@zif-8超声分散在甲醇中，并将其修饰在gce表面，空气流中干燥以获得cu2o@zif-8/gce。之后，对制备好的cu2o@zif-8/gce复合电极进行第一次pec测量。

26、为构建光电化学传感器，首先，将不同浓度的目标真菌毒素(10μl)添加到水凝胶中，孵育1h，在此过程中，dna水凝胶破裂并释放葡萄糖氧化酶(gox)。之后，将10μl 2.0mm葡萄糖加入到上述溶液中，孵育30min。期间，gox催化葡萄糖生成葡萄糖酸。随后，将10μl上述含有葡萄糖酸的反应液滴加到cu2o@zif-8/gce电极上孵育20min，cu2o@zif-8复合材料被裂解，用去离子水轻轻冲洗，进行第二次pec测量。

27、本发明的cu2o纳米颗粒具体制备方法如下：将5ml cucl2溶液(0.1m)和sds(0.87g)加入69.2ml去离子水中，在32-34℃下搅拌至sds溶解，超声分散5min。然后向混合溶液中加入naoh溶液(1.8ml 1.0m)和nh2oh·hcl溶液(24ml 0.1m)，超声1h，离心收集黄色沉淀。最后用水和乙醇体积比为1:1的混合溶液洗涤两次，分散在乙醇中备用。

28、本发明的cu2o@zif-8具体制备方法如下：将制备好的cu2o nps与pvp(1g)分散在20ml甲醇中，超声5min。之后依次加入20ml含有zn(no3)2·6h2o(0.7g)和pvp(0.25g)的甲醇溶液和另一等量的含2-甲基咪唑(0.26g)和pvp(0.25g)的甲醇溶液，在氩气氛围下50℃搅拌混合物1h。反应完成后离心收集沉淀，用甲醇溶液洗涤3次，放于60℃真空烘箱中干燥12h，得到cu2o@zif-8。

29、相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：

30、1)本发明采用cu2o@zif-8来产生光电流信号，将cu2o包封在zif-8材料中，zif-8不仅可以保护cu2o不被光腐蚀，增强其稳定性，而且与cu2o之间的协同作用也有效促进了载流子的迁移和空穴的产生，从而表现出强的光电流信号响应。

31、2)本发明采用了dna水凝胶的信号放大方法，dna水凝胶具有生物相容性、序列可设计性以及生物可降解性等，由于交联网络的存在，水凝胶可以在水中膨胀并保持一定的形状和体积，可以包裹gox，当真菌毒素与dna水凝胶上的真菌毒素适体结合，水凝胶破裂，释放出gox，催化葡萄糖生成葡萄糖酸，从而破坏zif-8。

32、3)本发明构建的用于真菌毒素检测的信号减小型光电化学传感策略，在0.0001～0.05ng ml-1浓度范围内，光电流与目标物浓度对数存在良好的线性关系，具有线性范围宽、检测线低的优点。