一种植物组织中环肽的检测方法与流程

本发明属于植物环肽检测，具体涉及一种植物组织中环肽的检测方法。

背景技术：

1、环肽是植物来源的超稳定肽，由于其头至尾的环化骨架以及结构中含有的3对二硫键，使它们对化学、热和生物降解相对稳定。近年来，由于环肽的独特优势及其多种生物活性，引起了众多科学工作者的重视。

2、文献报道的采用质谱直接分析的方式对植物环肽进行研究的方法，一般为新鲜或烘干的植物粉碎后，用一定浓度的甲醇或乙腈溶液提取、或二氯甲烷-甲醇（1:1）萃取后加水取水层，提取液还原烷基化后用maldi-tof或lc-ms/ms直接分析，通过对比数据库鉴定已知环肽的结构或者从头测序确定新环肽的结构。

3、目前最高效检测植物环肽的文献（cyclotides from the indian medicinalplant viola odorata (banafsha): identification and characterization），该文献先采用60%乙醇提取环肽，在还原和烷基化处理后，使用胰蛋白酶、lys-c和糜蛋白酶三种蛋白内切酶进行酶切处理，所得环肽进行液质联用分析。得到的质谱数据分别采用cybase数据库进行检索和从头测序法解析。最终该方法从紫花地丁提取物中鉴定到71条已知环肽和3条新环肽。此外，另外一篇文献（exploring the sequence diversity of cyclotidesfrom vietnamese violaspecies）采用相似的方法，从紫花地丁中鉴定到6条已知环肽和4条新环肽。再次，另外一篇文献（discovery and characterization of cyclotides fromrinorea species）采用相似的方法，从堇菜科植物中鉴定到8条环肽。

4、现有的方法主要存在以下几个问题：1）植物中广泛存在的色素等小分子物质极大地干扰了环肽的质谱检测，现有方法未对色素进行去除，使得方法的检测灵敏度偏低，使得检测所需样本量大，环肽的鉴定数目少；2）现有方法需要采用三种蛋白内切酶才能实现环肽的准确鉴定，实验繁琐，检测效率偏低；3）现有方法采用质谱从头测序法鉴定新环肽，但是从头测序的数据解析方法存在假阳性率高的问题，所得结果并不可靠，而现有方法并未对从头测序法鉴定到的环肽进行确证，所得结果可信度存疑。

5、因此急需建立一种灵敏度高、检测深度高、简便高效、结果可靠的植物环肽检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种灵敏度高、检测深度高、操作简单、结果可靠、纯化效果好的植物组织中环肽的检测方法。本发明通过合成一种改性琼脂糖材料作阳离子交换色谱材料，再结合阳离子交换色谱法、环肽专用氨基酸序列库和从头测序及验证等方法，实现了植物环肽的高灵敏度、高深度检测，并提升了新环肽的鉴定可信度。

2、一方面，本发明提供了一种植物环肽纯化和富集的方法，有效消除色素等小分子对植物环肽检测的干扰，从而显著提升环肽的检测灵敏和检测深度；第二方面，本发明提供了一种环肽专用的氨基酸序列库用于环肽质谱数据的解析，实现在单一酶切的情况下对环肽的准确鉴定，使得该方法更加简单高效；第三方面，本发明提供了一种质谱从头测序法结合基于数据库检索的方法，实现植物中新环肽发现和验证，提升了新环肽的鉴定可信度。所述方法包括以下步骤：

3、（1）采用液氮研磨和50%乙腈萃取进行植物中环肽物质的提取；

4、（2）对环肽提取物进行还原和烷基化处理，进而加入胰蛋白酶进行酶切处理；

5、（3）采用强阳离子交换色谱法对酶切后的环肽进行纯化和富集。

6、（4）采用高分辨液质联用仪对纯化富集后的环肽样本进行检测；

7、（5）对环肽数据库cybase中的环肽序列进行理论酶切处理，构建环肽质谱数据解析专用的氨基酸序列库并对采集到的质谱数据进行解析处理；

8、（6）采用从头测序法对采集到的环肽数据进行质谱解析，使用从头测序法检测到的环肽构建氨基酸序列库；

9、（7）采用基于数据库的搜库法对从头测序鉴定的新环肽进行验证。

10、步骤（2）所述的还原处理采用10 mm二硫苏糖醇37度反应1小时，步骤（2）所述的烷基化处理采用20 mm碘代乙酰胺，室温避光反应45分钟，步骤（2）所述的胰蛋白酶酶切处理，酶和蛋白的质量比为1:50，酶切条件为37度反应12小时。

11、步骤（3）所述的强阳离子交换色谱法是使用固定相中键合了磺酸基（-so3h）的固相萃取柱实现的。本方法采用强阳离子交换色谱法，实现了植物中环肽和色素等小分子的有效分离，从而实现了环肽的纯化和富集。

12、由于植物中色素含量丰富，会对环肽的质谱检测产生很大的干扰。然而，由于色素的亲疏水性与环肽相近，常规的反相色谱法无法有效区分环肽与色素。经过优化，本方法采用强阳离子交换法对提取后的环肽进行纯化，与常规的反相色谱相比，强阳离子交换法能够更有效的去除色素，显著提高环肽在质谱检测中的响应信号，提高了检测的灵敏度。

13、步骤（5）所述的cybase中环肽序列理论酶切处理为根据环肽的氨基酸序列，按照胰蛋白酶的酶切特异性将环肽序列中k或r的位置切断，得到新的肽段序列，采用所得的肽段序列构建新的数据库得到环肽数据解析专用的数据库。cybase网址为http://www.cybase.org.au/，步骤（5）所述的环肽质谱数据解析，使用的软件是proteomediscoverer 2.4。

14、步骤（6）所述的从头测序法环肽数据解析，使用的软件是maxquant 2.0.0.0，

15、步骤（7）所述的对从头测序所鉴定到的新环肽进行验证的方法，是基于数据库的搜库法，所使用的数据库为步骤（6）鉴定到的环肽序列，搜库所用的软件是proteomediscoverer 2.4。

16、本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

17、一种源自植物组织的环肽，包括：具有如下肽序：

18、肽1：vpcgdpsptcvntcntpgcscswpvctr；或，

19、肽2：vpcgetcvggavcqsntpgctcswpvctr；或，

20、肽3：vpcgetcvgilntcntpgcscswpvctr；或，

21、肽4：vpcgetcvavggtcntpgctcswpvctr；或，

22、肽5：vpcgetcvwvdvcptpgctcswpvctr；或，

23、肽6：vpcgetcvggtcpgedtpgcacswpvctr；或，

24、肽7：ngilpvcwtcmmfntcytpgcsctwpvctr；或，

25、肽8：ngilccegddcpapntpgcacswpvctr；或，

26、肽9：vpcgetcvghacgppptpgctcswpvctr。

27、优选地，植物组织为紫花地丁。

28、本发明公开了一种源自植物组织的环肽在制备药物和/或抑菌中的用途。

29、本发明公开了一种植物组织中环肽的检测方法，包括：

30、从植物组织中提取环肽并进行酶切处理，然后采用阳离子交换色谱法对环肽提取酶切物进行纯化，得到包括上述肽序的环肽的环肽酶切纯化物；最后对环肽酶切纯化物进行检测；

31、阳离子交换色谱法中采用改性琼脂糖材料，改性琼脂糖材料中具有4-羟乙基哌嗪乙磺酸基团和由环氧氯丙烷交联形成的交联结构。本发明中通过使用含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸基团及交联结构的改性琼脂糖材料，成功得到了多种已知环肽和未知环肽，进一步，本发明中改性琼脂糖材料还可以分离蛋白混合物，在交联结构及改性基团的相互作用下，对混合蛋白具有好的分离效果。

32、优选地，植物组织经液氮研磨以及萃取，得到环肽提取物；或，酶切处理中，将提取的环肽进行衍生以及采用蛋白酶进行酶切；或，检测中，采用高分辨液质联用仪对环肽提取酶切物进行检测。

33、优选地，萃取中，溶剂为裂解缓冲液，裂解缓冲液由乙腈、甲醇和去离子水组成；或，蛋白酶为胰蛋白酶；或，衍生中，采用二硫苏糖醇和碘乙酰胺进行处理。

34、优选地，改性琼脂糖材料的制备中，先由4-羟乙基哌嗪乙磺酸和对甲苯磺酰氯反应制成对甲苯磺酰基哌嗪衍生物；然后由琼脂糖微球和交联剂进行交联，得到琼脂糖交联材料；然后由对甲苯磺酰基哌嗪衍生物对琼脂糖交联材料进行改性，得到改性琼脂糖材料。

35、更优选地，对甲苯磺酰氯的使用量为4-羟乙基哌嗪乙磺酸的20-60wt%；或，交联剂为环氧氯丙烷，交联剂的使用量为琼脂糖微球的10-40wt%；或，交联处理中还含有碱性试剂；或，对甲苯磺酰基哌嗪衍生物的使用量为琼脂糖交联材料的5-20wt%；改性处理中还含有碱性试剂。

36、更进一步优选地，碱性试剂为氢氧化钠；或，琼脂糖微球由琼脂糖在水相和油相的混合乳液中制成。

37、优选地，检测方法中还包括对环肽数据库cybase中的环肽序列进行理论酶切处理，构建环肽质谱数据解析专用的氨基酸序列库并对采集到的质谱数据进行解析处理；或，检测方法还包括采用从头测序法对采集到的环肽数据进行质谱解析，使用从头测序法检测到的环肽构建氨基酸序列库；或，检测方法还包括采用基于数据库的搜库法对从头测序鉴定的新环肽进行验证。

38、优选地，对甲苯磺酰基哌嗪衍生物的制备中，将4-羟乙基哌嗪乙磺酸加入蒸馏水中，然后加入对甲苯磺酰氯，在20-40℃下搅拌3-12h，搅拌完成后调节ph至中性，然后在0-10℃下处理6-24h，析出沉淀，过滤，洗涤沉淀物，干燥，得到对甲苯磺酰基哌嗪衍生物。

39、更优选地，对甲苯磺酰基哌嗪衍生物的制备中，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的使用量为蒸馏水的10-30wt%，对甲苯磺酰氯的使用量为4-羟乙基哌嗪乙磺酸的20-60wt%。

40、优选地，琼脂糖微球的制备中，将琼脂糖加入蒸馏水中，在90-110℃下搅拌混合形成均匀的琼脂糖溶液，然后与90-100℃的油相混合，均质分散得到琼脂糖乳液，冷却，凝固成微球，经洗涤处理，得琼脂糖微球。

41、更优选地，琼脂糖微球的制备中，琼脂糖的使用量为蒸馏水的4-12wt%，油相由液体石蜡和石油醚混合而成，油相中液体石蜡和石油醚以质量比1：0.2-5的比例混合，油相的使用量为蒸馏水的80-120wt%。

42、优选地，琼脂糖交联材料的制备中，将琼脂糖微球加入乙醇溶液中，然后加入交联剂和碱性试剂，在20-40℃下搅拌反应12-48h，反应完成后，蒸馏水洗涤至洗涤液呈中性，得到琼脂糖交联材料。

43、更优选地，琼脂糖交联材料的制备中，乙醇溶液中含有40-60wt%的乙醇，琼脂糖微球的使用量为乙醇溶液的5-20wt%，交联剂为环氧氯丙烷，交联剂的使用量为琼脂糖微球的10-40wt%，碱性试剂为氢氧化钠，碱性试剂的使用量为琼脂糖微球的10-30wt%。

44、优选地，改性琼脂糖材料的制备中，将琼脂糖交联材料加入dmso中，然后加入对甲苯磺酰基哌嗪衍生物和碱性试剂，在20-40℃下反应2-6h，反应完成后，抽滤，洗涤，干燥，得到改性琼脂糖材料。

45、更优选地，改性琼脂糖材料的制备中，琼脂糖交联材料的使用量为dmso的10-30wt%，对甲苯磺酰基哌嗪衍生物的使用量为琼脂糖交联材料的5-20wt%，碱性试剂为氢氧化钠，碱性试剂的使用量为琼脂糖交联材料的2-8wt%。

46、优选地，改性琼脂糖材料的制备中还可以加入对甲苯磺酰乙酸，对甲苯磺酰乙酸的使用量为琼脂糖交联材料的1-5wt%。本发明在对琼脂糖交联材料进行改性时，还可以进一步加入对甲苯磺酰乙酸进行改性，在4-羟乙基哌嗪乙磺酸基团及交联结构存在下，对甲苯磺酰乙酸基团的引入，提高了改性琼脂糖材料对混合蛋白的分离效果。

47、优选地，环肽的提取中，将植物组织采用液氮研磨成植物组织粉末，将植物组织粉末加入裂解缓冲液中，超声裂解，离心分离取上清液，真空浓缩抽干，得到环肽提取物。

48、更优选地，环肽的提取中，裂解缓冲液由乙腈、甲醇和去离子水组成，裂解缓冲液中含有40-60wt%乙腈，裂解缓冲液中含有0.5-2wt%甲酸。植物组织粉末的使用量为裂解缓冲液300-500wt%。离心分离中，在0-10℃、10000-14000rpm离心5-30min。

49、优选地，环肽提取酶切物的制备中，将环肽提取物与二硫苏糖醇加入裂解缓冲液中混合，在20-40℃下还原0.5-2h，然后加入碘乙酰胺，在室温下避光孵育30-60min，然后加入蛋白酶进行酶解6-24h，酶解完成后采用tfa调节ph至2-3，离心分离取上清液，反相固相萃取柱脱盐处理，然后经真空浓缩抽干，得到环肽提取酶切物。

50、更优选地，环肽提取酶切物的制备中，环肽提取物的使用量为裂解缓冲液的1-5wt%，以裂解缓冲液的使用体积为基准，二硫苏糖醇的使用量为5-20mm，碘乙酰胺的使用量为10-30mm。蛋白酶为胰蛋白酶，蛋白酶的使用量为环肽提取物的1-3wt%，离心分离中，在20-40℃下、10000-14000rpm下离心5-30min。

51、优选地，环肽酶切纯化物的制备中，将环肽提取酶切物加入醋酸溶液中，然后采用阳离子交换固相萃取柱进行洗脱纯化处理，收集洗脱液，经真空浓缩，抽干，得到环肽酶切纯化物。

52、更优选地，环肽酶切纯化物的制备中，醋酸溶液中醋酸的含量为0.2-1wt%，环肽提取酶切物的使用量为醋酸溶液的1-5wt%，阳离子交换固相萃取柱中含有改性琼脂糖材料，洗脱纯化处理中，阳离子交换固相萃取柱采用0.2-1wt%的醋酸溶液进行清洗，然后采用含有0.2-1wt%醋酸、75-85wt%乙腈和余量为去离子水的溶液洗涤，最后采用0.05-0.2wt%的氨水、10-30wt%的乙腈和余量为去离子水的溶液进行洗脱，收集洗脱液。

53、优选地，环肽酶切纯化物的检测中，将环肽酶切纯化物采用超高效液相系统进行分离，环肽酶切纯化物经超高效液相系统分离后，进入质谱检测系统进行检测。

54、更优选地，环肽酶切纯化物的检测中，超高效液相系统分离中，采用easy-nlc1200超高效液相系统，环肽酶切纯化物溶于流动相a中，流动相a为含有0.1wt%甲酸和5wt%乙腈的水溶液，流动相b为含有0.1wt%甲酸的乙腈溶液，分离中液相梯度设置：0-38 min，8%~30%流动相b；38-52 min，30%~50%流动相b；52-56 min，50%~80%流动相b；56-60 min，80%流动相b，流速维持在500 nl/min。

55、优选地，环肽酶切纯化物的检测中，质谱检测中，经超高效液相系统分离环肽酶切纯化物注入nsi离子源中进行电离，然后进入orbitrap质谱进行分析。离子源电压设置为2.3 kv，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为400 - 1600 m/z，扫描分辨率设置为60000；二级质谱扫描范围固定起点为110 m/z，二级扫描分辨率设置为15000。数据采集模式使用数据依赖型扫描（dda）程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前25肽段母离子依次进入hcd碰撞池使用27%的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率，自动增益控制（agc）设置为100%，信号阈值设置为5e4 ions/s，最大注入时间设置为auto，串联质谱扫描的动态排除时间设置为20 s避免母离子的重复扫描。

56、本发明的检测方法还包括数据库构建和质谱数据解析。

57、将cybase中的所有环肽序列进行胰蛋白酶理论酶切，得到新的多肽序列，并构建环肽专用序列库。质谱数据解析使用proteome discoverer 2.4进行检索。检索参数设置如下：数据库设置为上述环肽专用的氨基酸序列，酶切方式设置为trypsin/p，漏切位点设置为2，一级母离子质量误差容忍度设置为10 ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度设置为0.02 da，固定修饰设置为半胱氨酸烷基化，可变修饰设置为甲硫氨酸的氧化，肽段离子打分要求高于20，鉴定结果peptide confidence设置为high，fdr控制在1%以内。

58、检测结果：本实施例每次上样为需1微克环肽样本，共进行三次技术重复，比较了环肽样本经强阳离子交换色谱法纯化前后的差异。

59、本发明的检测方法还包括从头测序法解析质谱数据。

60、质谱数据的从头测序解析使用maxquant 2.0.0.0完成。检索参数设置如下：选取软件中的从头测序模块，酶切方式设置为trypsin/p，一级母离子质量误差容忍度设置为10ppm；二级碎片离子的质量误差容忍度设置为0.02 da；固定修饰设置为半胱氨酸烷基化；可变修饰设置为甲硫氨酸的氧化。在对应用本实施例的样本进行描述时，如未特殊说明，均在实施例1的基础上制成。

61、本发明的检测方法还包括基于数据库检索的方法确认新环肽。

62、使用从头测序法鉴定到的环肽构建成新的多肽序列库，并导入到proteomediscoverer 2.4软件中，将质谱数据采用proteome discoverer 2.4重新进行检索。检索参数设置如下：酶切方式设置为trypsin/p，漏切位点设置为2，一级母离子质量误差容忍度设置为10 ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度设置为0.02 da，固定修饰设置为半胱氨酸烷基化，可变修饰设置为甲硫氨酸的氧化。

63、本发明由于采用了由上述方法制备的改性琼脂糖材料，采用阳离子交换色谱法去除色素干扰，使得环肽的质谱检测信号提升53%，环肽检测数目提升6.45倍，在3微克环肽提取物中即可鉴定到149条环肽；建立了一种环肽专用的氨基酸序列库用于环肽质谱数据的解析，实现在单一酶切的情况下对环肽的准确鉴定，与传统方法的2-3中酶切方法相比，流程更加简单高效；根据从头测序法所鉴定新环肽构建的谱图库，采用基于数据库检索的方法对新环肽进行二次确认，提升了新环肽鉴定的可信度，一次性从紫花地丁中鉴定到9条二级谱图质量良好的新环肽；因而具有如下有益效果：显著提升环肽的检测灵敏度和检测深度、实现在单一酶切的情况下对环肽的准确鉴定、提升了新环肽鉴定的可信度、环肽纯化效果好。因此，本发明是一种灵敏度高、检测深度高、操作简单、结果可靠、纯化效果好的植物组织中环肽的检测方法。