蛋白生物标志物IGFBP2在克罗恩病临床诊断中的应用的制作方法

本发明属于临床医学，具体涉及一组血清学生物标志物在克罗恩病临床诊断中的应用。

背景技术：

1、炎症性肠病(inflammatory bowel disease,ibd)是一种病因尚不完全明确的慢性非特异性肠道炎症性疾病，目前主流观点认为其主要是在具有遗传易感性的个体中，由于环境、饮食、药物、肠道菌群等多种因素的影响导致个体肠道免疫稳态失衡所导致的肠道炎症损伤，包括克罗恩病(crohn’s disease,cd)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,uc)。近年来，cd在我国的发病率呈逐年增高的趋势，发病率为0.848/10万人，患病率为2.29/10万人，比10年前增长2.5倍。cd临床症状主要表现为腹痛、腹泻、腹部包块、肛周瘘管等，病变呈多节段、跳跃式分布，常导致肠梗阻、狭窄、穿孔等，造成严重的肠道致残。由于其病情反复、迁延不愈，中青年发病率逐年增加，临床缺乏灵敏的早期诊断方法以及有效的治疗手段等特点，给个人、家庭及社会带来了沉重的负担，所以又被称为“绿色癌症”。目前，临床对于cd的诊断方法主要为内镜检查及活检组织病理学诊断，创伤性较大，给病人带来较大的痛苦，且费用相对较高，在临床的应用中不甚方便；而影像学检查对于cd的诊断价值较低，且血清及粪便的生物学标志物特异度或灵敏度较低。而早诊断、早治疗，对于cd患者的预后具有较大的益处，因此寻找便捷、有效的血清学生物标志物，在cd临床诊断、治疗及预后管理的过程中具有重要的意义。

2、现有技术中通过检测cd患者外周血crp水平来评估cd患者疾病活动程度。crp是一种非特异性急性炎症的血清学标志物，主要由由肝细胞合成，是机体受到感染和组织损伤时，血浆中能检测出的急性实相反应蛋白，与炎症因子存在着密切的相关性，且与cd的临床活动度有较强的正相关性，可以用于区分ibd与其他非炎症性胃肠道疾病。crp是一种非特异性的炎症标志物，在多种炎症情况下，包括感染以及其他导致组织炎症损伤的疾病中都会升高，特异度较低，仅可用于评估cd发生时患者系统性炎症反应水平，在一定程度上评估患者疾病的活动程度，而无法为精准诊断cd提供帮助。且尽管有些cd患者处于临床活动期，但是仍可表现出持续性低水平的crp，包括低bmi或单纯空回肠型cd患者。

3、此外，现有技术中还通过检测cd患者外周血中抗微生物相关抗体(如asca，cbir1，ompc)来诊断克罗恩病。抗多糖抗体是一类针对微生物(细菌、真菌)细胞壁多糖类抗原决定簇的抗体，作为cd相关的特异性血清学标志物已经被大部分临床医生认可，其中针对酿酒酵母菌细胞壁甘露聚糖的血清反应性抗体asca是第一个被发现对cd具有高度特异性的血清学标志物。目前临床上检测ibd患者外周血中asca的水平，来评估ibd患者的疾病行为和疾病活动程度。但是，有研究表明这些抗微生物相关抗体对于cd诊断普遍存在灵敏度低、阳性检出率低或特异性低等不足。

4、术语：

5、1、炎症性肠病，英文名为inflammatory bowel disease，缩写为ibd。

6、2、克罗恩病，英文名为crohn’s disease，缩写为cd。

7、3、血浆淀粉样蛋白-2，英文名为serum amyloid a2，缩写为saa2。

8、4、胰岛素样生长因子结合蛋白-2，英文名为insulin like growth factorbinding protein 2，缩写为igfbp2。

9、5、高尔基膜蛋白-1，英文名为golgi membrane protein 1，缩写为golm1。

10、6、二肽基肽酶-4，英文名为dipeptidyl peptidase 4，缩写为dpp4。

11、7、鸟苷酸结合蛋白-1，英文名为guanylate binding protein 1，缩写为gbp1。

12、8、“生物标志物”，在本文中或可写作“标志物”或“血清学标志物”，包括基于dna、rna、蛋白质、碳水化合物或糖脂的分子学标志物，在本文中指血清中的可溶性蛋白质分子标志物，它们的存在可以在受试者的或患者的外周血清样本中通过标准方法(本文中所涉及到的方法)进行检测。

13、9、“样品”是指来源于cd患者或健康受试者的外周血清样本，可以用过公知的技术获得。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一组具有高度灵敏度和特异度的cd血清诊断标志物集合，用于临床对于cd的早期诊断，以指导临床对于cd的治疗过程，并为进一步解释cd的病理生理学发病机制提供新的理论依据。

2、在前期工作中，我们收集了30例cd患者手术切除回肠肠段样本的炎症部位和相对正常部位组织，包括肠道黏膜层(muc)，黏膜下层-肌层-浆膜层(sms)，肠旁脂肪组织(mat)，肠系膜(mes)和肠系膜淋巴结(mln)，以及5例非cd患者(non-cd control，nc)对应的相对正常部位组织(此5位对照组入组患者为早期升结肠肿瘤患者，手术切除升结肠及回肠末端肠段，所取样本备份并进行免疫病理学检查，由两位以上专业病理科医生复核为非肿瘤侵袭的相对正常部位组织)。我们首先对上述样本进行蛋白质组学测序和16s rrna测序分析研究，描绘了cd肠道炎症发生过程中不同组织部位的蛋白质分子谱和细菌谱。随后我们根据差异蛋白质分子在cd患者不同组织部位的相对表达量的变化情况及差异菌种相关基因在cd患者不同组织部位相对表达量的变化情况绘制c-fuzzy图谱，统计学分析方法表明p.c1(protein cluster 1)和m.c1(microbial cluster 1)之间具有较强的相关性。随后我们对p.c1中的蛋白质分子和m.c1中的细菌基因进行相关性分析和功能注释后，鉴定出一系列关键的差异蛋白质分子和关键菌种，在cd肠道炎症发生过程中肠道炎症向肠外组织播散和菌群向肠外组织移位的过程中起到了重要的作用。

3、根据我们在前期工作中的研究结果，我们认为在cd肠道炎症发生的过程中，肠道及其附属器官不同组织内免疫调节的紊乱及物理屏障功能的破坏，可能参与了cd发生时肠道炎症向肠外组织的播散及菌群移位的过程，因此我们推测上述关键蛋白质分子和关键菌种是否能够在cd患者体液样本中具有诊断效能。于是我们收集了30例cd患者及30例健康对照者配对的外周血清及粪便样本，分别进行了血清非靶向蛋白质组学测序以及粪便16srrna测序分析，并与组织蛋白组学和细菌组学的结果进行比较，发现5种上述关键蛋白质分子在cd患者外周血清中存在差异表达的情况，包括saa2、dpp4、golm1、igfbp2和gbp1，且上述关键蛋白质分子和粪便中的关键菌种具有良好的相关性。

4、基于此，本发明的第一方面提出了一组血清学生物标志物在克罗恩病临床诊断中的应用，所述血清学生物标志物包括saa2、dpp4、golm1、igfbp2或gbp1蛋白质分子中的至少一种。

5、根据本发明所提供的应用，通过检测所述血清学生物标志物在受试者外周血血清中的表达水平，判断受试者是否患有克罗恩病。

6、具体来说，当受试者外周血血清中saa2、golm1、igfbp2或gbp1中至少一种的表达水平升高，指示所述受试者患有克罗恩病；当受试者外周血血清中dpp4的表达水平降低，指示所述受试者患有克罗恩病。

7、本发明的第二方面提供用于克罗恩病临床诊断的试剂盒，该试剂盒包括检测血清学生物标志物表达水平的试剂，所述血清学生物标志物包括saa2、dpp4、golm1、igfbp2或gbp1蛋白质分子中的至少一种。

8、优选地，在本发明所提供的用于克罗恩病临床诊断的试剂盒中，所述检测血清学生物标志物表达水平的试剂包括：基于rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序检测所述血清学生物标志物表达水平的试剂。

9、进一步优选地，所述基于rt-pcr检测所述血清学生物标志物表达水平的试剂至少包括一对特异扩增所述血清学生物标志物的的核酸序列的引物；所述基于实时定量pcr检测所述血清学生物标志物表达水平的试剂至少包括一对特异扩增所述血清学生物标志物的的核酸序列的引物；所述基于免疫检测技术检测所述血清学生物标志物表达水平的试剂至少包括与所述血清学生物标志物特异性结合的抗体；所述基于原位杂交检测所述血清学生物标志物表达水平的试剂至少包括与所述血清学生物标志物的核酸序列杂交的探针；所述基于芯片检测所述血清学生物标志物表达水平的试剂至少包括：蛋白芯片和基因芯片；所述蛋白芯片包括与所述血清学生物标志物特异性结合的抗体，所述基因芯片包括与所述血清学生物标志物的核酸序列杂交的探针；所述基于高通量测序检测所述血清学生物标志物表达水平的试剂至少包括：用于检测所述血清学生物标志物转录水平的引物和/或探针。

10、本发明的第三方面提供一种用于克罗恩病临床诊断的模块，该模块包括诊断指标输入模块和克罗恩病状态评估模块；所述诊断指标输入模块至少包括获取血清学生物标志物在受试者外周血血清中的表达水平，所述血清学生物标志物包括saa2、dpp4、golm1、igfbp2或gbp1蛋白质分子中的至少一种；所述克罗恩病状态评估模块至少包括将所述诊断指标输入模块获取的所述血清学生物标志物在受试者外周血血清中的表达水平输入诊断模型得出得分值；将所获得的得分值与预先设定的诊断模型的截断值比较，输出受试者克罗恩病状态的评估结果；所述克罗恩病状态包括诊断模型预先设定的克罗恩病相关状态。

11、本发明的第四方面提供一种用于筛选治疗克罗恩病的药物的方法，包括：在测试组中，向待测对象使用待测试药物，检测测试组中来源于所述对象的样品中血清学生物标志物的表达水平v1；在对照组中，向待测对象使用空白对照药物，检测对照组中来源于所述对象的样品中血清学生物标志物的表达水平v2；比较检测所得到的血清学生物标志物v1和v2，从而确定所述测试药物是否具有治疗克罗恩病的效能；所述血清学生物标志物包括saa2、dpp4、golm1、igfbp2或gbp1蛋白质分子中的至少一种。