一种利用液相色谱质谱法对血清中水溶性维生素及代谢产物进行测定的方法与流程

本发明涉及药物检测分析，具体涉及一种利用液相色谱质谱法对血清中10种水溶性维生素及代谢产物进含量测定的方法。

背景技术：

1、水溶性维生素主要包括维生素b1、b2、b3、b5、吡哆醛、吡哆酸、维生素b7、b9、5-甲基四氢叶酸及维生素c等。水溶性维生素为维持人体生理功能起到必需作用。检测血清中维生素含量可评估人体营养状况，指导临床用药，对因维生素缺乏或异常导致的疾病进行风险评估。目前，没有关于血清中维生素b1、b2、b3、b5、吡哆醛、吡哆酸、维生素b7、b9、5-甲基四氢叶酸及维生素c等水溶性维生素的液相色谱质谱检测方法。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种利用液相色谱质谱法对血清中10种水溶性维生素及部分代谢产物进行含量测定的方法，该方法能够简便、快速检测血清中维生素b1、b2、b3、b5、吡哆醛、吡哆酸、维生素b7、b9、5-甲基四氢叶酸及维生素c等成分的含量，并且具有简便、准确、重复性好、灵敏度高的特点。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种利用液相色谱质谱法对血清中10种水溶性维生素及代谢产物进含量测定的方法，包括下述步骤：

4、1)制备含有维生素b1、b2、b3、b5、吡哆醛、吡哆酸、维生素b7、b9、5-甲基四氢叶酸和的维生素c的混合标准工作溶液；

5、2)制备含有[13c4]-硫胺素、[13c4，15n2]-核黄素、[13c6]-烟酰胺、

6、[13c6,15n2]-泛酸钙、4-吡哆酸-d3、[2h3]-吡哆醛、生物素-d4、叶酸-d4、5-甲基四氢叶酸-[13c,d3]、[13c6]-抗坏血酸的混合内标工作溶液；

7、3)制备含有维生素b1、b2、b3、b5、吡哆醛、吡哆酸、维生素b7、b9、5-甲基四氢叶酸和维生素c的血清质控品溶液；

8、4)将血清样液及质控品溶液中加入内标工作液并加入磺基水杨酸溶液混合，经室温避光放置，离心后，取上清液，得到血清供试品溶液及质控品样液；

9、5)将步骤1)和步骤2)得到的混合标准工作溶液及混合内标工作溶液进行液相色谱质谱分析，获得每种目标物的保留时间、定性离子、定量离子信息及内标物的定量离子信息；

10、6)制备8个浓度点的血清基质加标工作曲线，得到基质加标系列浓度混合标准工作溶液；取基质加标系列混合标准工作溶液按照步骤4)方法处理后按照步骤5)方法依次进样，以目标物定量离子峰的峰面积比相应内标物定量离子峰的峰面积为纵坐标，对应目标物浓度为横坐标，绘制标准工作曲线；

11、7)将所述步骤4)得到的血清供试品溶液及质控品样液按照步骤5)相同条件下进行液相色谱质谱分析，获得每种化合物的保留时间、定性离子及定量离子信息，内标物仅采集定量离子信息；

12、8)将步骤7)测得目标物与相应内标物定量离子峰的峰面积之比代入步骤6)绘制的标准工作曲线，得到血清供试品溶液及质控品样液中各水溶性维生素及代谢产物的含量。

13、优选的，所述步骤1)中制备浓度为100μg/ml的维生素b1、b2、b3、吡哆醛、吡哆酸、维生素b7、b9、5-甲基四氢叶酸以及浓度为1.0mg/ml维生素b5、100mg/ml维生素c混合标准储备液；分别吸取适量的标准储备液，加入稀释剂配制成浓度为100ng/ml维生素b1、b2、b3、吡哆醛、吡哆酸、b9、5-甲基四氢叶酸以及浓度为500ng/ml的维生素b5、浓度为50ng/ml的维生素b7、浓度为100ug/ml的维生素c混合标准工作溶液。

14、优选的，所述步骤2)中制备浓度为200μg/ml的[13c4]-硫胺素、100μg/ml的[13c4，15n2]-核黄素、[13c6]-烟酰胺、[13c6,15n2]-泛酸钙、4-吡哆酸-d3、5-甲基四氢叶酸-13c,d3、50μg/ml的[2h3]-吡哆醛、生物素-d4、500μg/ml的叶酸-d4以及浓度为2mg/ml[13c6]-抗坏血酸内标标准储备液；分别吸取适量的内标储备液，加入稀释剂，配制成浓度为50ng/ml[13c4]-硫胺素、[13c4，15n2]-核黄素、[13c6]-烟酰胺、[13c6,15n2]-泛酸钙、[2h3]-吡哆醛、生物素-d4和浓度为25ng/ml4-吡哆酸-d3、浓度为100ng/ml叶酸-d4、浓度为150ng/ml5-甲基四氢叶酸-13c,d3以及浓度为2000ng/ml的[13c6]-抗坏血酸混合内标工作溶液。

15、优选的，所述步骤3)中制备浓度为10ng/ml维生素b1、b2、b3、吡哆醛、吡哆酸、b9、5-甲基四氢叶酸、50ng/ml维生素b5、5ng/ml维生素b7、10ug/ml维生素c的血清质控品溶液。

16、优选的，所述步骤4)中向血清样液及质控品溶液中加入内标工作液和磺基水杨酸溶液，混合，室温避光放置；再次混匀，涡旋震荡1min，然后以14000r/min转速离心5分钟；取上清液得到血清供试品溶液及质控品样液。

17、优选的，所述步骤5)中液相色谱质谱分析参数包括：色谱柱：premier beh c18 ax2.5um或1.8um,或其他柱效相当的色谱柱；色谱柱规格为2.1*100mm；流动相：a:高纯水+10mm乙酸铵，b:甲醇+0.15％甲酸；样品室温度：10℃，流速：0.3ml/min；柱温：50℃；梯度洗脱条件如下：

18、

19、

20、扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(mrm)；毛细管电压：0.5kv；锥孔电压：24v；离子源温度：150℃；去溶剂气温度：500℃；雾化气流速：1000l/hr；锥孔气流速：50l/hr；碰撞气：氩气；定性、定量离子对和锥孔电压、碰撞能量条件如下：

21、

22、

23、其中，*为定量离子，#为内标物。

24、优选的，所述步骤5)中维生素b1的保留时间为2.16min，维生素b2的保留时间为4.92min，维生素b3的保留时间为2.59min，维生素b5的保留时间为3.35min，吡哆醛的保留时间为2.36min，吡哆酸的保留时间为5.18min，维生素b7的保留时间为4.77min，维生素b9的保留时间为5.42min，5-甲基四氢叶酸的保留时间为5.13min，维生素c的保留时间为1.35min。

25、优选的，所述步骤6)中制备8个浓度点的血清基质加标标准工作曲线，取8个离心管，分别加入8个浓度点的血清基质加标样品，8个浓度点样品浓度如下：

26、

27、其中，维生素c为ug/ml，其他均为ng/ml；

28、按照步骤4)处理后按照步骤5)依次进样检测，以目标物定量离子峰的峰面积比相应内标物定量离子峰的峰面积为纵坐标，对应目标物浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，其线性相关系数r≥0.99；r<0.99时，需重新绘制标准工作曲线。

29、优选的，所述步骤5)中对质控品样液以及血清供试品进行检测，由标准工作曲线测得血清供试品溶液及质控品样液中各水溶性维生素及代谢产物含量，其中质控品样液中各成分含量与实际添加量偏差应≤15％，当偏差＞15％时，需对同批次测定的血清样品进行重新检测。

30、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

31、本发明用于对血清中维生素b1、b2、b3、b5、吡哆醛、吡哆酸、维生素b7、b9、5-甲基四氢叶酸、维生素c等水溶性维生素及代谢产物的含量进行检测，具有操作简便、灵敏度高、结果可靠的优点。