基于液相色谱串联质谱检测血浆中多种游离氨基酸的方法与流程

本发明涉及分析检测，具体地，涉及一种基于液相色谱串联质谱检测血浆中多种游离氨基酸的方法。

背景技术：

1、氨基酸是组成蛋白质的基本单位，目前为止，已发现300多种天然氨基酸。不同氨基酸在人体代谢过程中发挥着不同的功能，他们共同调节生命活动、维护身体的健康。氨基酸在人体内通过代谢可以发挥下列一些作用：①合成组织蛋白质；②变成酸、激素、抗体、肌酸等含氨物质；③转变为碳水化合物和脂肪；④氧化成二氧化碳和水及尿素，产生能量。因此，氨基酸在人体中的存在，不仅提供了合成蛋白质的重要原料，而且对于促进生长，进行正常代谢、维持生命提供了物质基础。如果人体缺乏或减少其中某一种，人体的正常生命代谢就会出现障碍，甚至导致各种疾病的发生或生命活动终止。

2、氨基酸是构成蛋白质的基本单位，而蛋白质是生命活动的主要承担者，因此氨基酸营养监测与人体健康息息相关。

3、1)评估人体营养状态，避免亚健康状态，避免相关疾病或疾病并发症的发生；

4、2)慢性疾病(如肝硬化、糖尿病等)的风险预测；

5、3)氨基酸代谢疾病(遗传)及其他疾病病因的辅助诊断，尽早诊断，尽早干预；

6、4)氨基酸制剂补充治疗患者的营养监测，辅助临床治疗补充方案的调整。

7、通过对人体21种氨基酸的准确检测，能全面准确的测定体内氨基酸平衡状态，揭示人体内详细的氨基酸代谢状况。直观判断体内的氨基酸水平，提供个体的营养、代谢、健康状况评估结果，并提供相应的营养改善和干预建议。

8、氨基酸分析方法有柱前衍生-离子交换色谱法、气相色谱、液相色谱、毛细管电容和液相色谱-串联质谱法(lc-ms/ms)等。传统的氨基酸分析主要是通过柱前衍生-离子交换色谱和邻苯二甲醛(opa)与氯甲酸芴甲酯(fmoc)柱前衍生-液相色谱分离-光度检测法检测完成的。柱前衍生-离子交换色谱法重复性高，但分析时间长，耗费高。柱前衍生液相色谱法是氨基酸分析中应用中最为广泛的一种方法，其中使用到的柱前衍生试剂有邻苯二甲醛、二甲氨基萘磺酰氯、异硫氰酸荧光素等。柱前衍生液相色谱法重复性和灵敏度均可以，但对分析物的特异性不强。而且这两种方法都不能区分14n和15n标记氨基酸，不能进行同位素标记定量。

9、随着现代氨基酸分析技术的发展，质谱作为高选择性和高灵敏度的检测工具，在氨基酸分析中发挥着重要作用。lc-ms/ms通过氨基酸的质荷比(m/z)进行准确的定量，可在一次分析过程中得到更多的氨基酸检测信息。与常用的毛细管电泳法、柱前衍生液相色谱法等方法比较，其检测限、精密度和检测准确度都比较高，为更快更准确的氨基酸定量检测提供技术基础。

10、目前液相色谱串联质谱技术检测血浆中的氨基酸主要是两种技术方案，一种是通过使用异硫氰酸苯酯、丹磺酰氯等衍生试剂先对血浆中的氨基酸进行衍生，然后再对衍生后的血浆进行处理，处理后的血浆在c18反向色谱柱上实现多种氨基酸的分离后，再进入质谱进行检测。衍生的一个主要目的是增强氨基酸与色谱柱固定相的相互作用，由于大部分氨基酸的极性较大，在普通的c18反向色谱柱上难以保留，无法实现多种氨基酸在色谱住上的分离，通过衍生试剂与氨基酸进行反应，可以使之生成极性相对较小的衍生物，从而实现在反向色谱住上的保留和分离。另外一种技术方案是通过在流动相中加入全氟羧酸类的离子配对试剂，离子配对试剂与氨基酸通过离子相互作用配对，从而降低氨基酸的极性，实现在c18反向色谱柱上的保留和分离。上述两种技术方案都有各自的缺点，衍生法前处理流程比较复杂，干扰反应多，部分衍生试剂毒性较强。离子配对试剂的使用会加速对质谱仪离子源的污染，增加质谱仪维护成本，进而提高检测成本。另外上述两种方案检测一个样本的机时一般都长达几十分钟，检测效率较低。除此以外，血浆中存在分子量相同的氨基酸同分异构体，这也要求在色谱上对这类氨基酸实现良好的分离，以防止在质谱检测时由于相同的质荷比而产生干扰，影响检测结果。

11、专利cn110018266b，一种快速定量分析48种氨基酸的方法，该专利主要为用正丙醇和3-甲基吡啶作为衍生剂，对氨基酸进行衍生后上样液相色谱-串联质谱检测。但是其前处理复杂且耗时长，进样分析时间需要20多分钟，检测效率低。专利cn112730723a，一种超高效液相色谱-串联质谱检测血浆中22种游离氨基酸的方法：样本经甲酸甲醇和乙酸乙酯萃取，氮吹干后复溶进行检测，样本分析检测时间15分钟。前处理需要氮吹耗时长，色谱流动相中加了七氟丁酸离子对试剂，会对质谱仪产生污染，增加质谱仪维护成本。专利cn116087371a，一种快速分析血浆中多种氨基酸的液相色谱串联质谱的方法，通过对血浆进行蛋白沉淀处理后，上样液相色谱串联质谱检测。该方法用蛋白沉淀去提取氨基酸，样本净化的不干净、基质效应非常大，容易对色谱柱和质谱仪产生污染。使用的亲水色谱柱，容易导致后续大量样本检测时目标物保留时间漂移，色谱不稳定。hilic模式因色谱稳定性差，不适用于大批量的样本检测。专利cn114624338a，利用液相色谱-串联质谱定量分析生物样本中游离氨基酸的方法，采用甲醇沉淀血浆后，离心取上清液氮吹干，复溶后上样液相色谱串联质谱检测。采用蛋白沉淀后，氮吹复溶上样，样本净化效果差，容易污染色谱柱和质谱仪；采用waters的t3色谱柱分析检测，由提供的谱图看，不能将同分异构体亮氨酸和异亮氨酸分开，会导致这两个同分异构体定量不准确。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于液相色谱串联质谱检测血浆中多种游离氨基酸的方法，包括如下步骤：对血浆样品进行前处理，向血浆样品中加入适量同位素内标后，再加入释放剂，涡旋振荡设定时间1使样品混合均匀，将全部样品转移至超滤管中，高速离心设定时间2，取出超滤管，转移下层离心出来的提取液至进样板中，上样液相色谱-串联质谱仪进行检测。

2、本发明方法的原理：通过调节血浆样本的ph值，使样本中氨基酸游离，采用超滤方式截留血浆中的蛋白质和色素等大分子，使氨基酸得到提取和净化，通过色谱柱分离多种氨基酸，在液相色谱-串联质谱系统上采用多反应监测(mrm)模式定量检测。

3、本发明的目的可以通过以下方案来实现：

4、第一方面，本发明提供一种基于液相色谱串联质谱检测血浆中多种游离氨基酸的方法，所述方法包括以下步骤：

5、s1、将血浆样品、内标溶液混合后，加入释放剂调节ph至小于5；，并进行超滤；

6、s2、将步骤s1超滤后的下层提取液进行液相色谱-串联质谱检测。

7、作为本发明的一个实施方案，步骤s1中，所述血浆样品、内标溶液和释放剂的体积比为80-120：10-30：40-60。

8、作为本发明的一个实施方案，步骤s1中，所述内标溶液为含丙氨酸-is、精氨酸-is、天冬氨酸-is、瓜氨酸-is、谷氨酸-is、甘氨酸-is、亮氨酸-is、蛋氨酸-is、鸟氨酸-is、苯丙氨酸-is、酪氨酸-is、缬氨酸-is、苏氨酸-is、丝氨酸-is、天冬酰胺-is、脯氨酸-is、异亮氨酸-is、组氨酸-is、色氨酸-is、赖氨酸-is、谷氨酰胺-is浓度均为2μg/ml-20μg/ml的盐酸水溶液。

9、作为本发明的一个实施方案，步骤s1中，所述释放剂选用浓度为0.02m-0.2m的盐酸溶液。

10、作为本发明的一个实施方案，步骤s1中，调节ph至小于5；ph值偏大会有色氨酸、酪氨酸、缬氨酸与蛋白结合在一起，不能被超滤。

11、作为本发明的一个实施方案，步骤s1中，所述混合的方式为涡旋振荡；涡旋振荡的时间为2-20min。

12、作为本发明的一个实施方案，步骤s1中，所述超滤的装置包括超滤管、超滤板中的任意一种；超滤管的规格为1-10kd，1.0-5.0ml；超滤板的规格为1-10kd，200-2000μl。

13、作为本发明的一个实施方案，步骤s1中，采用超滤管时，超滤的速度为12000-15000r/min，时间为15-30min；采用超滤板时，超滤的压强为0.1-0.4mpa，时间15-30分钟。

14、优选地，超滤的装置为超滤板。在一些实施例中，将步骤s1混匀后的样本转移至3kd，350μl的超滤板中，超滤板的下面放96孔接收板，一一对应孔位，将组装好的超滤板和接收板放在正压装置上，0.2mpa压滤20分钟，取下96孔接收板，直接上液相色谱-串联质谱仪检测。

15、本发明通过超滤将氨基酸从血浆样本提取，无需衍生，方法简单快速，基本上在30min内就能完成氨基酸的前处理。加入同位素内标稀释后，降低基质效应和干扰，保证定量的准确性和稳定性。

16、作为本发明的一个实施方案，步骤s2中，所述进样板为96孔进样板。

17、本发明中，液相色谱-串联质谱采用的液相色谱串联质谱仪为上海睿康生物科技有限公司的rz-500系列。

18、作为本发明的一个实施方案，步骤s2中，液相色谱-串联质谱的参数包括：

19、色谱条件：

20、流动相a：含0.01％-0.5％甲酸的水溶液；

21、流动相b：含0.01％-0.3％甲酸的乙腈溶液；

22、色谱柱型号：c18 30x100mm 3μm；

23、柱温：40℃；

24、进样量：2μl；

25、采用梯度淋洗的方式，流速及梯度如下：

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27、

28、质谱条件：

29、电喷雾离子源(esi)，正离子mrm扫描分析，离子源参数：喷雾电压3000v，传输管温度280℃，离子源温度350℃，鞘气40arb，辅助气25arb；q1/q3离子通道分别选择为：

30、

31、

32、本发明使用反相色谱系统，通过选择耐水反相c18色谱柱作为氨基酸的色谱柱，在流动相里不加离子对试剂的前提下，可保证21种氨基酸有色谱保留。以添加0.1％甲酸的乙腈和0.2％甲酸的水为流动相，采用梯度洗脱的方式，在6分钟时间内完成21种氨基酸的色谱分离，保证每个氨基酸都有很好的信号，同分异构体能达到基线分离。色谱分离用时短能很大提高氨基酸的检测通量，提高检测效率。可用于大量样本的快速提取。

33、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

34、1、本发明通过超滤法，可以快速实现氨基酸的提取，可以在30min内完成提取净化。

35、2、本发明相较于传统的蛋白沉淀方法，样本净化的更干净、彻底，能很大程度降低在进样分析检测时对色谱柱和质谱仪的损耗和提高检测的灵敏度。

36、3、本发明的前处理基本没有对样本产生稀释，能检测更低浓度氨基酸含量的血浆样本。

37、4、本发明采用超高效液相色谱-串联质谱方法检测21种氨基酸，该方法同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测。特异性高，可以极大的避免交叉反应的干扰，从而提高准确度。

38、5、本发明采用同位素内标法定量，可以极大的消除基质效应，能够达到准确定量。

39、6、本发明的方法为高通量，一次前处理，一针进样可同时检测21种氨基酸，能检测的氨基酸种类非常全面。

40、7、本发明采用的仪器分析时间短，6分钟之内就能完成检测分析，对于大量样本的检测具有重要意义。

41、8、本发明的方法无需衍生，能够实现同分异构体的基线分离。

42、9、本发明的方法检测重复性好、特异性好、灵敏度高。

43、10、本发明的方法中样品处理简单、自动化程度高。