一种高危型HPV检测试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及体外诊断，具体是一种高危型hpv检测试剂盒及其制备方法。

背景技术：

1、人乳头瘤病毒（human papillomavirus，hpv）是一种嗜上皮组织的无包膜双链环状dna病毒，专性侵染和寄生人体生殖器官及其它组织器官的上皮细胞，引起人体皮肤、黏膜的增生性病变。目前hpv已发现和鉴定出200多个亚型，大约有54种可以感染生殖道黏膜，依据各型hpv与宫颈癌发生的危险性不同分为高危型和低危型两大类。

2、高危型hpv主要有 hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 型，几乎所有的宫颈癌都由高危型hpv持续感染引起，最常见的是hpv16型和18型，我国超过84.5%宫颈鳞癌病例与hpv 16、18型感染有关。《宫颈癌诊疗指南（2022年版）》指出，宫颈/阴道细胞学涂片检查和hpv检测是现阶段发现早期宫颈癌及癌前病变（cin）的初筛手段，hpv检测可以作为宫颈液基薄层细胞学检查（tct）的有效补充，两者联合检测有利于提高筛查效率。

3、hpv病毒基因组分为3个部分：早期基因区e、晚期基因区l和长调控区lcr。早期区编码e6、e7、e1、e2、e4和e5蛋白质，主要参与病毒dna的复制、转录，其中e6/e7是致癌基因；晚期区编码l1、l2蛋白质，分别是病毒的主要和次要衣壳蛋白。从低级别病变发展为癌的过程中，hpv基因组会发生整合，在整合过程中，e6/e7基因持续存在，而l1基因可能会丢失。以l1基因作检测靶点，会对hpv检测存在漏检的可能。相反，以e6/e7基因作为检测靶点，不论基因组是否发生整合，都不会存在漏检的可能性。

4、鉴于目前hpv尚不能进行体外培养，高危型hpv的检测均是基于hpv dna的分子诊断技术。hpv dna的检测需要依赖设备、操作要求高且较易产生污染、检测周期长，无法实现快速或otc检测。因此，建立一种宫颈样本或尿液样本中高危型hpv的快速便捷的检测方法，可有效促进高风险人群在无症状阶段的主动筛查，降低隐形感染风险。

5、随着hpv疫苗的推广接种，hpv抗体的检测已无法准确的实现疾病诊断。目前国内已有专利涉及侧向免疫层析法检测hpv抗原，其标记物为胶体金。胶体金具有等离子体特性，其颗粒小、制备需高温沸腾、原材料价格昂贵，作为标记物使用往往灵敏度低且成本高。与胶体金相比，胶体硒作为非金属胶体颗粒具有对电解质不敏感、常温制备、方法简单、原材料成本低等优点，已经逐渐被应用于侧向免疫层析试剂。然而胶体硒由于粒径小、分散性差等缺点，这些年发展缓慢，应用并不广泛。因此，急需制备一种粒径大、成本低、分散性好的纳米颗粒应用于侧向免疫层析平台以提高检测灵敏度。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高危型hpv检测试剂盒及其制备方法，检测基因型为hpv16型和18型，检测介质为宫颈样本或尿液样本，采用硅芯硒壳纳米颗粒作为标记物，制备成本低，检测灵敏度高。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种高危型hpv检测试剂盒的制备方法，包括标记垫的制备方法，标记垫的制备方法为：将hpv16 e6/e7-2抗体-硅芯硒壳标记物和hpv18 e6/e7-2抗体-硅芯硒壳标记物按1:1体积比混合均匀后喷射于玻璃纤维ma0800上，即得标记垫，hpv16 e6/e7-2抗体-硅芯硒壳标记物和hpv18 e6/e7-2抗体-硅芯硒壳标记物均由硅芯硒壳纳米颗粒溶液作为示踪物标记制得。

3、所述hpv16 e6/e7-2抗体-硅芯硒壳标记物的制备方法：取5ml硅芯硒壳纳米颗粒溶液，用0.1m碳酸钾调节ph至8.0；迅速加入0.5mg/ml hpv16 e6/e7-2抗体，充分反应10min，加入终浓度1%的bsa，充分反应10min，10000rpm离心15min，5ml重悬液重悬得hpv16e6/e7-2抗体-硅芯硒壳标记物；

4、所述hpv18 e6/e7-2抗体-硅芯硒壳标记物的制备方法：取5ml硅芯硒壳纳米颗粒溶液，用0.1m碳酸钾调节ph至8.0；迅速加入0.5mg/ml hpv18 e6/e7-2抗体，充分反应10min，加入终浓度1%的bsa，充分反应10min，10000rpm离心15min，5ml重悬液重悬得hpv18e6/e7-2抗体-硅芯硒壳标记物；

5、所述硅芯硒壳纳米颗粒溶液利用种子生长法，先对二氧化硅微球进行表面接枝改性，再在改性snps表面进行peg修饰，以peg修饰snps为硅芯种子，二氧化硒为生长液，在硅芯种子表面再生长硒壳层，制得核壳结构的硅芯硒壳纳米颗粒。

6、所述硅芯硒壳纳米颗粒溶液制备方法包括如下步骤：

7、s1、二氧化硅微球的制备：采用stober法制备二氧化硅微球，制备过程中，通过调控氨水浓度制得粒径110nm的二氧化硅微球，经hno3酸化、离心水洗，最终制得表面带正电荷的浓度为1mg/ml的二氧化硅微球。

8、s2、peg修饰二氧化硅微球溶液的制备：对s1制得的二氧化硅微球进行表面接枝改性，丁二酸酐作为改性剂，进行表面羧基功能基团化，得羧基化二氧化硅微球。取10ml羧基化二氧化硅微球，加入10ml peg溶液，常温条件下以500rpm高速搅拌30min，超声分散10min，离心水洗3次，10ml超纯水重悬得peg修饰二氧化硅微球溶液。

9、s3、硅芯硒壳纳米颗粒溶液的制备：取50ml超纯水置于100ml烧杯中，加入0.2%阿拉伯胶、1% pvp作为稳定剂，搅拌溶解；加入s2制得的peg修饰二氧化硅微球溶液10ml作为硅芯种子，加入0.3m二氧化硒10ml作为生长液，加入抗坏血酸10ml作为还原剂，常温条件下100rpm搅拌反应30min，使得胶体硒聚集在微球表面形成硒壳，离心水洗3次，10ml超纯水重悬得硅芯硒壳纳米颗粒溶液，4℃冰箱内保存待用。

10、硅芯硒壳纳米颗粒的粒径为150-200nm。

11、作为一种优化方案，所述peg溶液浓度为0.5%-1.5%；

12、作为一种优化方案，所述抗坏血酸的浓度为0.6-1.5m；

13、作为一种优化方案，一种高危型hpv检测试剂盒的制备方法，还包括固相反应膜的制备方法，固相反应膜的制备方法为：分别将hpv16 e6/e7-1抗体、hpv18 e6/e7-1抗体和羊抗鼠抗体作为检测t1线、检测t2线和质控c线包被于nc膜；

14、作为一种优化方案，一种高危型hpv检测试剂盒的制备方法制备的试剂盒，包括测试条，测试条包括pvc板，pvc板上从左到右依次设有吸水纸、固相反应膜、标记垫、样品垫。

15、作为一种优化方案，一种高危型hpv检测试剂盒的制备方法制备的试剂盒，检测介质为宫颈样本时还包括裂解液，所述裂解液包括100~150mm pbs溶液、质量百分比0.05%np40和质量百分比0.01% x-100。

16、本发明采取以上技术方案，具有以下优点：本发明标记物为一种粒径为150-200nm的硅芯硒壳纳米颗粒，制备无需昂贵的氯化金原材料和繁琐的高温沸腾制备步骤，相比传统的胶体金颗粒，制备成本低。二氧化硅微球外层包覆一层硒壳，增加了纳米颗粒的粒径和表面积，使得纳米颗粒表面有更多的位点与标记蛋白结合，提高标记蛋白标记固化率，从而提高与包被抗体的结合力，相比传统的胶体硒标记，检测灵敏度更高。

17、本发明硅芯硒壳纳米颗粒的制备及应用，是本试剂盒提高灵敏度的关键技术之一。制备的二氧化硅微球首先进行酸化，无数正电荷形成的电荷层使得微球稳定、均匀的分布于溶剂中。对二氧化硅微球进行羧基化修饰，使得peg与二氧化硅微球结合更加牢固、致密，在二氧化硅微球表面形成一层peg非免疫致密层。peg非免疫致密层的引入，在增强二氧化硅胶体稳定性的同时还可以控制胶体硒的生长速度，提高胶体硒的结合效率。通过控制硒生长液和抗坏血酸的比例，调节硒在二氧化硅微球表面的生长速度及覆盖量，从而调控硅芯硒壳颗粒的形状、粒径及分散性。