一种全血中25-羟基维生素D的检测方法与流程

本发明涉及医学分析检测，尤其涉及一种全血中25-羟基维生素d的检测方法。

背景技术：

1、维生素是维持机体正常生理功能、维持细胞内特异代谢反应所必须的一类小分子有机物，是人体健康所必须的一类基本营养物质，在调节物质代谢过程中发挥重要作用。维生素d属于脂溶性维生素，是调节骨代谢的重要维生素，婴幼儿缺乏维生素d会导致佝偻病，成人缺乏会导致骨质疏松症。当机体摄入并蓄积过量的维生素d时，体内维生素d负反馈调节作用失调，会导致高钙血症及一系列不良反应如恶心、呕吐、便秘、胰腺炎、急性肾脏损伤等。25-羟基维生素d半衰期较长，体内存在形式稳定且浓度较高，是监测体内维生素d营养水平的标志物。25-羟基维生素d2和25-羟基维生素d3是25-羟基维生素d在血液循环中的主要存在形式，可作为维生素d的检测指标，因此，监测人体内25-羟基维生素d2和25-羟基维生素d3的含量，有助于评价人体维生素d的状况。

2、现有技术中大多都是针对血清样本进行分析检测，较少有直接采用人全血样本检测其中的25-羟基维生素d含量的检测方法。即便是采用人全血的样本进行检测，也均是通过液相色谱-串联质谱法进行检测。例如cn 115980211 a通过液相色谱-串联质谱法实现了对血斑、血清、血浆、全血等多种标本中25-羟基维生素d的检测。但是，质谱仪设备昂贵、使用和维护成本较高，制约了采用质谱仪的相关检测方法在一些基层医院和科研单位的使用。

技术实现思路

1、为了解决上述技术难题，本发明提供了一种定量检测全血中25-羟基维生素d的高效液相色谱法。具体
技术实现要素：
包括如下：

2、首先，本发明提供了一种全血中25-羟基维生素d的检测方法，包括：

3、将全血样本与乙腈混合后离心，取上清液进行氮吹和复溶后，采用高效液相色谱等度洗脱的方式进行检测；

4、所述高效液相色谱的检测条件包括：

5、c18色谱柱，其规格为（4~6）μm，（4~5）×（95~105）mm；

6、所述等度洗脱的流动相包括流动相a和流动相b；

7、流动相a为乙酸水溶液，流动相b包括体积比为（15~20）:（0.8~1.2）:1的甲醇、异丙醇和异丁醇；

8、所述等度洗脱过程中流动相a和流动相b的体积百分比之和为100%，流动相a的体积百分比为22%~26%。

9、由于血清和全血中所含的杂质存在较大差异，针对血清的蛋白沉淀剂不一定仍然适用于全血样本的蛋白沉淀过程，因此，发明人针对全血样本以及采用高效液相色谱检测所需满足的进样要求，对大量蛋白沉淀剂的选用进行优化，包括单独采用乙腈、采用甲醇乙腈异丙醇混合液、以及在其基础上添加硫酸锌以及硫酸铵溶液后，最终发现单独采用乙腈和全血样本直接混合后，蛋白沉淀的效果最佳且高效液相色谱的响应值较好，前处理方法高效、简便。

10、由于选择不同的蛋白沉淀剂对全血样本的蛋白沉淀效果存在较大差异，导致前处理后的待测样本中的杂质种类和含量也存在较大差异，因此发明人进一步针对采用乙腈蛋白沉淀后的前处理样本，对色谱条件进行组合优化，最终获得了上述高效液相色谱的检测条件。

11、通过上述前处理方法以及上述液相色谱条件的联合应用，能够实现准确、高效地同时检测全血中25-羟基维生素d3和25-羟基维生素d2。

12、优选地，所述全血为人全血。

13、更优选地，所述人全血为人毛细血管全血。

14、更优选地，所述人全血为人指尖毛细血管全血。

15、本发明中的检测方法能够准确定量检测出25-羟基维生素d3和25-羟基维生素d2，但是本领域公知，仅依靠25-羟基维生素d3和25-羟基维生素d2的指标并不能够直接指向特定的疾病，因此本发明的检测方法并不涉及疾病的诊断与治疗。

16、优选地，乙腈与全血样本的体积比为1：（0.4~0.6）。

17、优选地，乙腈与全血样本的体积比为1：（0.47~0.53）。

18、控制乙腈和全血样本的体积比在上述范围内，能够使得蛋白沉淀的效果更好且使得高效液相色谱的响应值更高。

19、优选地，所述流动相b还包括乙酸。

20、优选地，乙酸的体积与所述流动相b中甲醇、异丙醇和异丁醇的总体积的比例为（680~720μl）：1l。

21、最优选地，流动相b包括体积比为900ml：50ml：50ml：700μl的甲醇、异丙醇、异丁醇和乙酸。

22、优选地，所述流动相a中乙酸与水的体积比为（320~380）μl：500ml。

23、最优选地，流动相a包括体积比为500ml：350μl的水和乙酸。

24、优选地，所述离心的转速为12000 rpm以上；离心时间为8min以上。最优选为13000rpm以上离心10min以上。

25、优选地，所述氮吹的温度为60℃以上。

26、在上述氮吹温度下能够使得氮吹时间进一步缩短，有利于节约前处理时间。

27、优选地，所述复溶采用的复溶液为乙腈水溶液。

28、通常复溶液与流动相组分保持一致，从而避免溶剂效应的产生，然而本发明发现在本发明的前处理过程中选择乙腈水溶液，也可以消除溶剂效应，且配制使用更方便。

29、优选地，乙腈占所述复溶液的体积百分比为75%~85%，最优选为80%。

30、优选地，复溶液的添加体积为70~90μl，最优选为80μl。

31、优选地，所述c18色谱柱为svea色谱柱。

32、本发明进一步发现选择svea（瑞典nanologica公司）色谱柱的检测效果更佳，采用月旭的相同规格的色谱柱（ultimate xb-c18，货号为00201-31041）基线鼓包。

33、优选地，等度洗脱的流速为1~1.2 ml/min。

34、优选地，所述氮吹和复溶后，振荡离心，然后采用高效液相色谱等度洗脱的方式进行检测。

35、优选地，所述氮吹和复溶后，先在1500rpm以上振荡，然后离心，而后采用高效液相色谱等度洗脱的方式进行检测。

36、优选地，将全血样本与乙腈混合后，先在3000rpm以上振荡后离心。

37、优选地，离心的温度优选为2~6℃。

38、优选地，离心后取200μl~250μl上清液进行氮吹。

39、在一些实施方案中，将校准品、质控品与样本进行相同的前处理。

40、在一些实施方案中，采用外标法建立标准曲线实现定量分析检测。

41、在一些实施方案中，通过内标法定量分析检测。

42、本领域技术人员可以进一步通过对上述优选方案进行组合，以得到本发明检测方法的其它较优实施方案。

43、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

44、本发明提供了一种能准确、高效地同时检测全血中25-羟基维生素d3和25-羟基维生素d2的高效液相色谱法。该方法能满足相关法规对25-羟基维生素d检测的线性、重复性、准确度、精密度、基质效应、特异性等要求，无需对全血进行血清分离的步骤，实现了直接对全血中25-羟基维生素d3和25-羟基维生素d2的准确检测，便于临床实现快速对全血中25-羟基维生素d的监测需求。