本发明属于蛋白质检测，具体涉及一种单抗类药物低丰度宿主细胞残留蛋白的定量检测方法。
背景技术：
1、生物制品，如抗体药物、重组蛋白药物等的制备是通过生物体系合成，尽管能够通过多种纯化过程有效地去除多种杂质，但生产工艺过程中仍然可能会残留微量的宿主细胞蛋白(host cell proteins,hcps)。单抗类药物中残留的hcps是生物制品生产过程中的关键工艺相关杂质之一，hcps作为外源蛋白可能会在不同程度上引发机体的免疫应答，导致过敏或其它不良反应，也有可能引起产品中辅料成分的降解，影响药物的稳定性。因此，对抗体药物中hcps的定性与定量检测显得尤为重要。
2、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,elisa)一直是生物制品开发和质量控制中检测hcps的最常用方法，但是其对hcps的覆盖和具体识别信息仍然具有局限性，该方法中使用的多克隆抗体无法覆盖到无免疫原性或免疫原性较弱的hcps。鉴于高分辨质谱作为一种高精密度、高准确性的检测方法，其对hcps的检测有较好的特异性，可应用于单抗类药物生产工艺中hcps的监测。
技术实现思路
1、本发明旨在提供一种单抗类药物低丰度宿主细胞残留蛋白的定量检测方法，该方法有助于更全面识别单抗类药物中低丰度宿主细胞残留蛋白，能够高效、准确地测定单抗类药物中宿主细胞蛋白残留量。
2、为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：
3、一种单抗类药物低丰度宿主细胞残留蛋白的定量检测方法，包括以下步骤：
4、(s.1)分别称取各内标蛋白并用缓冲液配制、稀释得到各内标蛋白工作液；
5、(s.2)向超滤管中加入超纯水并离心，去除甘油，然后加入单抗样品并离心，加入缓冲液进行置换，得到置换后的单抗样品溶液并对其进行总蛋白量测定；
6、(s.3)向经过预饱和的离心管中加入步骤(s.2)中得到的置换后的单抗样品溶液，并加入步骤(s.1)中得到的各内标蛋白工作液，再加入缓冲液混匀，得到混合液；混合液经非变性酶解、沉淀去除单抗主蛋白，采用脱氧胆酸钠变性酶解，得到酶解肽段；然后向酶解肽段中加入甲酸，去除生成的脱氧胆酸钠沉淀，再对酶解肽段进行脱盐、复溶处理，离心，取上清，得到包含宿主残留蛋白的肽段和各内标蛋白的肽段的混合肽段溶液并对其进行总肽段含量测定，将混合肽段溶液转移至进样瓶，得到待测进样溶液；
7、(s.4)采用纳升液相色谱-串联高分辨质谱对步骤(s.3)中得到的待测进样溶液进行检测并收集数据，采用蛋白组学数据处理软件proteome discoverer 3.0进行数据分析，分别筛选并计算得到有无单抗基质的样品中内标蛋白的响应值，从而计算得到内标蛋白回收率校正因子，筛选并计算得到宿主残留蛋白的响应值，进一步计算得到单抗样品中宿主残留蛋白的含量。
8、由于在单抗类药物中存在药物基质的影响，本发明基于蛋白组学的非标记定量技术，即利用蛋白响应最高的3条肽段(hi3 peptides)响应之和的比值与其物质的量成正比，通过引入内标蛋白回收率校正因子，利用内标蛋白对单抗样品中的宿主残留蛋白进行相对定量。本发明的定量检测方法有助于更全面识别单抗类药物中低丰度宿主细胞残留蛋白，提升基于蛋白组学技术的单抗类药物中低丰度宿主细胞残留蛋白相对定量方法的准确性，可用于评估单抗类药物中宿主细胞蛋白残留量，为生物制品质量控制提供技术支持。本发明的定量检测方法能够鉴定到的含量最低的外源性宿主细胞残留蛋白的质量浓度约为0.3ppm，检测下限低，结合质谱分析方法，检测高效、准确，精密度高。
9、本发明基于非靶向蛋白质组学，对单抗中包含的蛋白进行全面分析，从而获得宿主残留蛋白定性信息。同时，本发明通过添加的内标蛋白，在计算时引入内标蛋白回收率校正因子，进一步得到单抗样品中所有宿主残留蛋白相对定量结果。
10、作为优选，步骤(s.1)中的内标蛋白为细胞色素c、α-乳蛋白、c反应蛋白、硫氧还蛋白1、肌红蛋白、血红蛋白s中的任意一种或多种的组合。
11、作为优选，步骤(s.3)中对离心管进行预饱和的具体方法如下：
12、用牛血清白蛋白对离心管进行预饱和，使用前弃去离心管中的溶液。
13、作为优选，步骤(s.3)中按置换后的单抗样品溶液中每含有500μg单抗蛋白加入10ppm的硫氧还蛋白1、15ppm的肌红蛋白、20ppm的细胞色素c、40ppm的血红蛋白s、50ppm的α-乳蛋白和50ppm的c反应蛋白。
14、作为优选，步骤(s.3)中得到酶解肽段的具体过程为：
15、向混合液中按酶:蛋白＝1:400(w/w)加入胰蛋白酶，37℃酶切2h；加入二硫苏糖醇使其终浓度为5mm，95℃变性10min，14000g离心15min，取上清；加入10％脱氧胆酸钠使其终浓度为1％；加入二硫苏糖醇使其终浓度为5mm，95℃反应10min，冷却至室温；加入碘乙酰胺使其终浓度为10mm，避光反应30min；加入胰蛋白酶，37℃酶切过夜；加入10％甲酸使其终浓度为1％，混匀，14000g离心15min，取上清。
16、作为优选，步骤(s.3)中脱盐、复溶处理的具体过程为：
17、用c18脱盐柱对酶解肽段进行脱盐处理后，去除溶剂，用甲酸-水溶液复溶。
18、作为优选，步骤(s.4)中计算得到内标蛋白回收率校正因子的计算公式如下：
19、
20、作为优选，步骤(s.4)中分别筛选并计算得到有无单抗基质的样品中内标蛋白的响应值的方法如下：
21、采用蛋白组学数据处理软件proteome discoverer 3.0进行数据分析得到数据表，从数据表中筛选出响应最高的3条肽段，计算响应最高的3条肽段的响应值之和并将其作为内标蛋白的响应值。
22、作为优选，步骤(s.4)中计算得到单抗样品中宿主残留蛋白的含量的计算公式如下：
23、式中：i表示内标蛋白，n表示内标蛋白数量。
24、作为优选，步骤(s.4)中筛选并计算得到宿主残留蛋白的响应值的方法如下：
25、采用蛋白组学数据处理软件proteome discoverer 3.0进行数据分析得到数据表，从数据表中筛选出特征肽段数量不小于2的目标蛋白并从目标蛋白对应的肽段中选取肽段，计算选取得到的肽段的响应值之和并将其作为宿主残留蛋白的响应值。
26、因此，本发明具有以下有益效果：
27、(1)本发明基于蛋白组学的非标记定量技术，即利用蛋白响应最高的3条肽段(hi3peptides)响应之和的比值与其物质的量成正比，通过引入内标蛋白回收率校正因子，利用内标蛋白对单抗样品中的宿主残留蛋白进行相对定量；
28、(2)本发明的定量检测方法有助于更全面识别单抗类药物中低丰度宿主细胞残留蛋白，提升基于蛋白组学技术的单抗类药物中低丰度宿主细胞残留蛋白相对定量方法的准确性，可用于评估单抗类药物中宿主细胞蛋白残留量，为生物制品质量控制提供技术支持；
29、(3)本发明的定量检测方法能够鉴定到的含量最低的外源性宿主细胞残留蛋白的质量浓度约为0.3ppm，检测下限低，结合质谱分析方法，检测高效、准确，精密度高。