专利名称：粒子分析装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及使含有血液或尿之类中的粒子(血球、细胞等)的试样液在屏蔽流中流动，用光照射该试样液流，并检测来自粒子的光，对粒子进行分析的装置，详细地说，涉及测定在扁平的屏蔽流槽中流动的粒子形态信息或吸光率等用的带有一维图像传感器(例如行传感器)检测系统的流式血细胞计数器(flowcytometer)等粒子分析装置。
所谓屏蔽流(sheathflow)，是指为了使粒子以较高的精度排列成一排，从液流的中央部位通过，而在粒子的悬浮液的周围包围一层层流的屏蔽液的液流。
以往所知的作为用光照射在流体中移动的粒子，取出该粒子的特征进行分析的装置，有流式血细胞计数器、细胞分类器或成像流式细胞观察仪。
美国专利第4338024号说明书及特公平3-52573号公报中记载了在流槽中形成扁平的试样液流(扁平屏蔽流)，并拍摄用闪光灯照射的粒子的静止图像的方法。
特开平2-105041号公报公开发表了用光偏转元件使光束沿着与粒子通过的方向交叉的方向扫描。用陈列型光检测器检测透过粒子内部的光，从而获得粒子各部分的信息的方法。
特开平3-29835号公报公开发表了在光轴上设置平行平面玻璃板，通过使该玻璃板旋转，使光偏移，调整光轴的方法。
特开平3-150444号公报公开发表了设置使激光沿水平方向(与粒子流正交的方向)扫描的声光元件和沿垂直方向扫描的声光元件，并使水平扫描的光跟踪粒子的移动，对同一粒子进行数次扫描的方法。另外，还公开发表了使沿流动方向的扫描速度比流速慢一些的方法。
采用原有的流式血细胞计数器，不能获得各粒子的形态信息(面积、周长等)。另外，使试样呈扁平流，用闪光灯照射，并对用视频照相机拍摄的粒子图像进行图像处理，按实时求出各粒子的形态特征，这时必须使用价格昂贵的视频照相机及价格昂贵的高性能专用图像处理装置。
因此，本发明人发明了在原有的流式血细胞计数器上附加由一维图像传感器(行传感器)构成的检测系统及其信号处理系统，对在扁平式屏蔽流槽中流动的粒子的像进行扫描，并对这时获得的检测信号进行处理，能按实时求出各个粒子的形态信息或吸光量的分析装置，并申请了专利(特愿平3-270106号、3-270107号、4-179297号)。
然而，在上述发明中，由于由行传感器决定的扫描循环时间及粒子像分辨率之间的关系，需要将粒子的移动速度(试样流速)抑制在最大为100毫米/秒左右。因此，每单位时间内的分析量与原来的流式血细胞计数器相比，减少到1/5～1/10。因此，特别是对作为对象的粒子的浓度稀薄的试样来说，在短时间内不可能测定足够数量的粒子。也就是说，(1)如果加快试样流速，则在粒子流动方向上的图像分辨率变坏，所得到的形态信息的精度下降。(2)为了缩短由行传感器决定的扫描周期，如果使用像素数少的行传感器，则在与流向垂直的方向上的分辨率变坏。(3)虽然还有通过提高相对于行传感器的像素时钟脉冲频率来缩短扫描周期的方法，但有来自信号处理速度方面的制约。
有关这些问题，还要稍加详细地说明。在流槽中，含有粒子的试样呈流体力学上的扁平流，即液流沿光轴方向薄，沿与流向垂直的方向宽广。因此，每单位时间内通过行传感器分析的试样容量，由试样流的厚度、行传感器的检测范围的幅度及试样流的速度决定。就是说，试样流的速度要兼顾行传感器进行一次扫描所需要的时间和液流方向上的粒子像的分辨率而决定。越使试样流的速度加快，则液流方向上的粒子像的分辨率越坏，所获得的形态信息的精度越低。为要进行精度好的测量，还与行传感器的像素数有关，但通常需控制在50毫米/秒左右，这时每单位时间内的试样分析量，与原来的流式血细胞计数器相比，变成约1/10左右。
为了提高单位时间内的试样分析量，除了提高试样流的速度之外，还可以考虑增加试样流的厚度的方法，或者减小向行传感器受光面上投影的放大率，以及扩大行传感器的检测范围的幅度。但是，这些方法中存在粒子像聚焦模糊的问题或在与流向垂直的方向上的像分辨率下降的问题。
另外，在上述特开平3-29835号公报记载的发明中，之所以要旋转玻璃板，是为了调整光轴，以获得最佳的光学准直性，如后面所述，这与本发明的目的不同。
特开平2-105091号公报及特开平3-150444号公报记载的发明，虽然使光沿水平方向进行高速扫描，但动作的稳定性有可能欠妥。
在特开平3-150444号公报中，虽然公开发明了使光跟踪粒子移动、对粒子进行若干次扫描，但这是对同一粒子的中心进行若干次扫描，而没有公开对同一粒子的不同部分进行扫描的方法。另外，之所以沿流向的扫描速率比流速慢一些，是为了提高激光照射粒子中心的概率。
如上所述，当使流动的粒子的透射光在一维图像传感器(行传感器)中成像，对该检测信号进行处理，求各粒子的形态信息时，如果粒子的移动速度过快，就不能求出精度好的信息。反之，如果移动速度慢，单位时间内测定的细胞数就会减少。
本发明就是针对上述各问题完成的，它是使用能够用电学方法改变光轴倾角的光偏转装置，只减慢投影在一维图像传感器(行传感器)上的粒子像的移动速度，改善了上述问题。
本发明的目的在于提供这样一种粒子分析装置，即通过使用角度可变棱镜、声光偏转器、电光反射镜(ガルバノミラ-)等光偏转装置，即使粒子的移动速度快，也能使投影在行传感器受光面上的粒子像的移动速度变慢。
为了达到上述目的，本发明的粒子分析装置，如
图1所示，从流槽的喷嘴喷出含有被检测粒子的试样液，同时在试样液的周围有屏蔽液流动，因此而形成屏蔽流，用光照射该试样液流，并检测来自粒子的光，根据该检测信号，对粒子进行分析，在该粒子分析装置中具有流槽18、照射光学系统、一维图像传感器24、光偏转装置14、信号处理装置26和控制装置28。
流槽18用来形成沿一个方向的幅度窄、沿另一方向的幅度宽的扁平的试样液流19。
照射光学系统用来使来自光源10的光，从试样液流的幅度宽的一面照射试样液流。
一维图像传感器24是将多枚光敏元件沿与粒子流方向垂直的方向排成一排设置而成，粒子的透射光在其受光面上成像，每次扫描i都输出横过粒子扫描的摄像信号Si。
光偏向装置14用来使在试样液流19上投影的上述一维图像传感器24的检测区B1沿粒子的流动方向移动。
信号处理装置26用来根据来自一维图像传感器24的摄像信号Si检测粒子，并逐个求出各粒子的各种特征参数。
控制装置28根据粒子检测定时信号Sp控制光偏转装置14的动作，使检测区B1沿与粒子的移动方向相同的方向、以与粒子的移动速度V1不同的速度V2移动，同时使粒子对检测区B1的相对移动速度(V1-V2)小于粒子的实际移动速度V1，以便增加对同一粒子的扫描次数。
另外，本发明的其他粒子分析装置，如图9所示，备有在上述粒子分析装置中从试样液流的幅度宽的一面照射试样液流的第二光源38，以及检测由于该第二光源38的照射而从粒子上发出的散射光或荧光等的光检测器46。
控制装置28根据由光检测器46的信号S检测粒子的粒子检测定时信号Sp，控制光偏转装置14的动作，以便使检测区B1沿着与粒子的移动方向相同的方向、以与粒子的移动速度V1不同的速度V2移动。
在上述图1及图9所示的粒子分析装置中，光偏转装置14或者是由于夹在两块透明板之间的折射率大的介质的厚度是可变的，所以能使光偏转的角度可变棱镜，或者是声光偏转器或电光反射镜等。关于角度可变棱镜、声光偏转器及电光反射镜，将在实施例中说明。
图1是表示本发明的粒子分析装置的一个实施例的侧视说明图。
图2是沿图1中的光轴看流槽时所看到的试样液流部分的放大图，是表示行传感器的检测区B1及照射光的照射区A1的图。
图3是表示图1中的角度可变棱镜的初始状态的说明图。
图4是表示图1中的角度可变棱镜的偏转状态的说明图。
图5是表示图1中的成像光学系统部分的初始状态的放大说明图。
图6是表示图1中的照射光学系统部分的偏转状态的说明图。
图7是表示细胞(粒子)扫描之一例的说明图。
图8是表示每次扫描i从行传感器输出的摄像信号之一例的波形图。
图9是表示本发明的粒子分析装置的另一实施例的俯视说明图。
图10是光检测器的信号S、粒子检测定时信号Sp及角度控制信号Sa的时间图。
图11是表示信号处理装置之一例的方块图。
图中10光源14光偏转装置(角度可变棱镜、声光偏转器或电光反射镜)18流槽19试样液流20粒子
24一维图像传感器(行传感器)26信号处理装置28控制装置38第二光源42信号处理装置44数据分析装置46光检测器下面参照附图详细地说明本发明的最佳实施例。但是，本实施例中所述结构中的装置的材质、形状及其相对配置等，只要无特别的说明，本发明的范围不只限于此，只不过是说明例。
实施例1图1是表示本发明的粒子分析装置的基本结构图(侧视图)。18是形成扁平试样液流19用的流槽。该流槽18由玻璃、塑料等透明物质构成，含有被检测粒子的试样液流(试样流)19被导入扁平的流槽18，并向流槽中供给屏蔽液，以便覆盖试样流周围，形成扁平屏蔽流。
试样液流19沿Z方向(纸面上下方向)流动，沿Y方向(纸面左右方向)的幅度窄，与粒子直径的尺寸大致相同，沿X方向(与纸面垂直的方向)的幅度宽，为粒子直径的数倍以上，形成扁平的液流。24是沿X方向设置的一维图像传感器(行传感器)。
图2是沿光轴看流槽18时所看到的试样液流部分的放大图。20是要进行分析的被检测的粒子(例如血球或细胞)。以下将20简称为粒子。B1是在试样液流上形成的行传感器24的检测区。像素沿X方向排成一排。
在图1中，从光源10发出的白光通过准直透镜12而成为平行光，再通过柱面透镜16后，如图2中的A1所示，形成沿X方向的宽度大于试样液流19的宽度、而沿Z方向的厚度为粒子直径的数倍的椭圆形的光，照射在检测区B1上。A1是从光源10发出的光的照射区。也就是说，由准直透镜12和柱面透镜16构成照射光学系统。
粒子20能够移动，到达检测区B1时，透过粒子的透射光经过物镜22、投影透镜23后，在行传感器24的受光面上成像，每次扫描i时，都从行传感器24输出横过粒子20扫描的摄像信号Si。摄像信号Si输入到信号处理装置26中，对各粒子按实时求出各种特征参数。
在本发明的装置中，在受光系统(图1中在物镜22和投影透镜23之间)中设有光偏转装置14。所谓光偏转装置，就是能改变光轴方向的装置，具体地说，可以使用通过改变中间夹着折射率大的介质的两片透明板的倾角来改变光的方向的角度可变棱镜、或使超声波在介质中传播，通过改变该超声波的频率来改变光的方向的声光偏转器(Acousto-OpticDeflector∶AOD)、或通过改变反射镜的角度来改变光的方向的电光反射镜等。角度可变棱镜、声光偏转器、电光反射镜可分别从例如キヤハノ(佳能)公司、HOYA公司、ジェネラハスキニンゲ公司获得。
图3及图4是表示角度可变棱镜的结构略图。图3表示初始状态，图4表示偏转状态。角度可变棱镜14是由两片透明板30、32(例如玻璃板或塑料板)、两板的周围连接着波纹板34、内部封入折射率大的透明液态物质36(例如硅酮类液体)构成的。而且利用音圈等电动驱动装置(未画出)，可任意改变两片板30、32的角度，如图4所示，可以使光束从虚线向点划线所示的方向偏转。
检测区B1如图2所示，首先设定在照射区A1中的上游部位。在本发明中，利用角度可变棱镜14使检测区B1移动。当能够流动的粒接近检测区B1时，根据粒子检测定时信号Sp，在控制装置28中发生角度控制信号Sa，利用该控制信号Sa，将角度可变棱镜14的偏转角度控制在给定的角度，使检测区B1沿与粒子的流动方向相同的方向移动。另外，在本实施例中，粒子检测定时信号Sp由信号处理装置26供给。
图5及图6是成像光学系统部分的说明图。图5是细胞到达检测区B1上端的状态，即初始状态。角度可变棱镜14的两片玻璃板呈平行状态。与粒子20移动的同时，根据角度控制信号Sa，如图6所示，两片玻璃板30、32的角度开始改变，检测区B1沿与粒子的移动方向相同的方向(在图5及图6中向下)、以比粒子的移动速度V1小的速度V2移动。因此可使粒子相对于检测区B1的速度(V1-V2)小于粒子的实际移动速度V1。也就是说，可使外观上粒子的移动速度变慢，这时，如图7所示，对一个粒子可进行多次扫描。另外，图7中()内的数字表示扫描循环的序号，V是一次扫描过程中粒子移动的距离。图8表示每次扫描i从行传感器24依次输出的摄像信号Si。
这样，即使对于移动速度比以往快的粒子，也能与以往一样对一个粒子进行多次扫描。另外，当粒子的移动速度与以往相同时，可以进行比以往的次数多的扫描(即可以进行精度较高的分析)。
实施例2图9表示在图1所示装置中附加了检测散射光及荧光用的光学系统的装置的俯视图。38是第二光源，例如发射波长488纳诺米的激光的氩离子激光器。第一光源10发出的光的波长与第二光源38的波长不同，例如是发出近红外光的激光二极管。扁平的试样液流19沿与纸面垂直的方向(Z方向)流动，第二光源38沿着与第一光源10相垂直的方向设置，以便朝向其出射面。来自第二光源38的光被分色镜48反射，通过柱面透镜16，沿细胞的流动方向(Z方向)会聚成一束细光，从试样液流19的幅度宽的一面照射。这样，来自第一光源10的光与来自第二光源38的光照射在试样液流19上相同的区域或两个极其接近的区域。
试样液经过荧光染色处理。被荧光染色的细胞被来自第二光源38的光照射后受激而发出荧光。从细胞发出的侧面荧光由聚光透镜40会聚后，透过分色镜50，在分色镜52上反射，最后作为对象的荧光被光检测器46b接收。由来自第二光源38的照射光产生的侧面散射光，被分色镜50反射后，被光检测器46a接收。
来自第一光源10的光经过准直透镜12后成为平行光，再透过分色镜48，通过柱面透镜16后，与实施例1一样，如图2所示，对试样液流19进行椭圆状照射。粒子透射光像经过物镜22、滤光器54，入射到角度可变棱镜14上。入射到角度可变棱镜上的光最好是平行光，作为物镜22，可以使用例如焦距无限长的透镜。滤光器54用来阻断来自第二光源的光，而让来自第一光源的光透过。
来自第一光源的经角度可变棱镜14偏转后的照射光产生的粒子透过光像，经过投影透镜23，在行传感器24的受光面上成像。
在本实施例中，根据由光检测器46a的检测信号S1或光检测器46b的检测信号S2(光检测器46的检测信号S)得到的从信号处理装置42发出的粒子检测定时信号Sp，在控制装置28中得到角度控制信号Sa。图10是这些信号S、Sp、Sa的时间图。当以S1作为检测信号S时，可将全部粒子作为扫描对象，当以S2作为检测信号S时，能仅将发荧光的粒子作为扫描对象。在与粒子检测定时信号Sp上升的同时，为了使角度可变棱镜14的偏转角度能随粒子的移动而慢慢地改变，因此角度控制信号Sa的峰值慢慢地上升，在与粒子检测定时信号Sp下降的同时，Sa返回初始状态。
另外，在实施例1中，根据行传感器24的信号Si产生粒子的检测定时信号Sp。
由光检测器46a、46b及行传感器24检测到的信号，在信号处理装置42中，对各个粒子按实时求出特征参数。所谓特征参数，是指荧光强度、散射光强度、面积或圆度等形态信息、以及吸光度或复杂度等而言。求这些特征参数的方法，详细地记载于本申请人申请的特愿平3-270106号、特愿平3-270107号、特愿平4-179297号说明书。
即，用光检测器46b检测荧光强度，用光检测器46a检测侧面散射光强度。
另外，将行传感器24对流动粒子产生的检测信号输入到信号处理装置42中进行处理后，可获得粒子的形态信息及吸光信息等。
图11所示是对从行传感器24获得的检测信号Si进行处理的信号处理装置26之一例。
来自行传感器24的信号Si由放大器62放大后，用与行传感器的移位时钟脉冲频率相同的取样时钟脉冲，通过A/D转换器64进行A/D转换(模拟/数字转换)，并由背景修正部分66对该数据进行修正处理。在背景修正部分66中，可将粒子不通过检测部分时的透射光产生的一行的数据预先存储在存储器中，按实时进行导出与检测过程中得到的A/D转换数据之差的处理。该处理的目的在于对激光束的照射不均或行传感器的各像素的灵敏度的离散偏差等进行修正。
修正后的数据，由于已将被粒子遮住的透射光像所对应的信号范围分出来，所以与某适当的基准电平的数据进行比较，由双值化处理部分68进行双值化处理。再者，由于只将沾染重的核心部分分出来，所以也可以进行与其电平比上述基准电平高的数据相比较的双值化处理。
双值化处理后的数据，除去了少量无用数据，划分出与一个一个粒子对应的双值数据范围。即由双值数据处理部分70进行区域划分的前处理。这里所说的区域划分处理，就是划分出在连续的若干行数据中出现的一个粒子所对应的双值化数据范围(定时)，是产生按实时对一个一个粒子的形态信号或吸光信息进行运算用的定时控制信号所需要的处理。
根据来自该区域划分处理及运算控制电路72的控制信号，对求吸光量、复杂度及形态信息用的运算器74进行控制，可实时求出各粒子的参数。
另外，可以这样控制，即利用经双值数据处理后的数据，由同时通过判断部分76判断粒子是否同时通过，以便忽略这时得到的参数。78是微分器，80是吸光量运算部分，82是复杂度运算部分。这里所说的复杂度，是指将检测信号中的A/D转换后的数据的相邻数据的差分，将在一个粒子对应的范围内紧挨着的值(复杂量)再按面积分配的值而言。作为复杂量也可以用相邻数据的差分的二次方数据，即用在一个粒子对应的范围内紧挨着的值。
由信号处理装置42求得的粒子的各特征参数数据被送到数据分析装置44中，作成二维散布图或一维直方图等，进行高精度的粒子分类等的分析。
由于本发明具有上述结构，所以具有下述效果。
1在获得粒子的透射光像用的受光光学系统中附加了光偏转装置，能在粒子移动的同时，使在一维图像传感器的受光面上投影的粒子像移动。也就是说，一维图像传感器的受光面能够使在试样液流上投影的检测区移动。因此，可使粒子对检测区的相对移动速度减慢，即使粒子的实际移动速度很快，也能对同一粒子进行多次扫描。即能够增加单位时间内分析的粒子数。
或者粒子的移动速度保持不变，则可增加对同一粒子的扫描次数。即可提高粒子流动方向的图像分辨率，能更精确地求出形态信息等特征参数。
权利要求
1.一种粒子图象分析装置，包括一个流槽，用于包围含有待分析的粒子、具有一层屏蔽流的一个液流，以使该液流成为一种试样液流；一个照射光学系统，用于发光以照射试样液流；一个一维图象传感器，用于接收经过粒子透射的光，以扫描粒子并输出有关粒子的图象信号；光偏转装置，其偏转角是可变的，用于偏转将被投射到图象传感器的透射光；控制装置，用于控制光偏转装置的偏转角度，使图象传感器能光学上跟踪粒子；以及信号处理装置，用于处理图象传感器的输出图象信号，以分析粒子。
2.根据权利要求1所述的装置，其中控制装置控制光偏转装置的偏转角，使得一维图象传感器以速度V2光学跟踪以速度V1移动的粒子，速度V1和V2的关系为V1＞V2＞0，从而使图象传感器多次扫描相同的粒子。
3.根据权利要求1所述的装置，其中控制装置根据一维图象传感器的输出信号，实现对光偏转装置的偏转角的控制。
4.根据权利要求1所述的装置，其中信号处理装置进一步包括以一定周期输出一个扫描信号的装置，而一维图象传感器与该扫描信号同步，输出图象信号。
5.根据权利要求1所述的装置，其中试样液流是一种扁平流，且照射光学系统是这样构成的，它照射相对于试样液流较宽的一侧。
6.根据权利要求1所述的装置，其中一维图象传感器是这样配置的，使其能沿横过试样液流的方向扫描粒子。
7.一种粒子图象分析装置，包括一个流槽，用于包围含有待分析的粒子、具有一层屏蔽流的一个液流，以使该液流成为一种试样液流;一个第一照射光学系统，用于发射照射试样液流的第一光;一个一维图象传感器，用于接收经过粒子透射的第一光，以扫描粒子并输出有关粒子的图象信号;光偏转装置，其偏转角可变，用于偏转将被投射到图象传感器的透射第一光;控制装置，用于控制光偏转装置的偏转角度，使图象传感器能光学上跟踪粒子;一个第二照射光学系统，用于发射出照射将被第一光照射的粒子的第二光;光检测装置，用于检测来自被第二光照射的粒子的散射光和/或荧光，以便输出检测信号;及信号处理装置，用于根据图象传感器和光检测装置的输出信号，分析粒子。
8.根据权利要求7所述的装置，其中第一光与第二光的波长不同。
9.根据权利要求7所述的装置，其中光检测装置包括检测来自粒子的散射光的散射光检测装置，控制装置根据散射光检测装置的输出信号实现对光偏转装置的偏转角的控制。
10.根据权利要求7所述的装置，其中光检测装置包括检测来自粒子的荧光的荧光检测装置，控制装置根据荧光检测装置的输出信号，实现对光偏转装置的偏转角的控制。
11.根据权利要求1所述的装置，其中光偏转装置包括一个角度可变棱镜，它通过改变置于两片透明板之间的光学介质的厚度来偏转光，光学介质具有高的折射率。
12.根据权利要求1所述的装置，其中光偏转装置包括一个声光偏转器。
13.根据权利要求1所述的装置，其中光偏转装置包括一个电光反射镜(galvano-mirror)。
全文摘要
一种能高精度地获得血液或尿等的试样中含有的粒子(血球、细胞等)的形态信息、吸光信息等特征参数的粒子分析装置。包括形成扁平试样液流的流槽、使来自光源的光从试样液流的幅度宽的一面照射的照射光学系统、每次扫描都输出横过粒子扫描的摄像信号的一维图像传感器、使一维图像传感器的检测区沿粒子的流动方向移动的光偏转装置、根据摄像信号求出各种特征参数的信号处理装置、以及控制光偏转装置的动作的控制装置。
文档编号G01N21/00GK1086314SQ9311932
公开日1994年5月4日 申请日期1993年10月20日 优先权日1992年10月21日
发明者小坂时弘, 前川泰范 申请人:东亚医用电子株式会社