抗呼吸道合胞体病毒的单克隆IgA抗体的制作方法

专利名称：抗呼吸道合胞体病毒的单克隆IgA抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗呼吸道合胞体病毒(RSV)的单克隆IgA抗体及其在治疗和诊断上的应用。
RSV以可预见的一年一度的爆发出现。早在1940年代初，就已注意到婴幼儿下呼吸道疾病的一年一次的爆发(Adams，J.Pediatr20405-420，1941)。1956年发现RSV后，即刻将其与这些疾病爆发的主要原因相联系(Morris et al.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.92544-549，1956；Chanock et al.，Am.J.Hyg.，66281-290，1957)。RSV感染成人以及未成年人，且主要在婴幼儿、患有肺或心疾病的儿童、免疫受损者和老人中引起严重的下呼吸道疾病(Mac-Intosh et al.，Virology(Fields和Knipe编著)1045-1074，1990)。RSV感染与40％至50％的患细支气管炎而住院的儿童和25％的患肺炎的儿童有关(Heilman，J.Infect.Dis.161402-406，1990)。1993需要住院的病例数目估计为91,000，花费大约300,000,000美元(Heilman，J.Infect.Dis.161402-406，1990)。医院中此病毒的蔓延是特别严重的问题。当RSV感染在医院出现时，20％至45％的婴儿可能获得医院RSV感染(Graman et al.，Infect.Dis，Clin.N.Amer.3815，1989)。早产婴儿和因心或肺疾病住院的患者由此处于感染下呼吸道疾病的极度危险中。在一项患先天性心疾病的儿童的研究中，21％的RSV感染是在医院获得的(Graman et al.，In-fect.Dis.Clin.N.Amer.3815，1989)。
目前，尚未研制出抗RSV的有效疫菌。作为保护高危患者，特别是未成年人的活性疫苗的替代方法是，在已知的暴发期被动施用抗体来保护这些孩子。用具有抗RSV活性的免疫球蛋白(IgG)静脉注射已在临床上进行测试(Hemming et al.，Antimicrob.AgentsChemother.311882-1886，1987；Groothuis et al.，Antimi-crob.Agents Chemother.351469-1473，1991)。虽然静脉注射IgG可预防下呼吸道疾病，结果表明需要大剂量的此物质。这种治疗不无潜在的不利影响，包括容量过载和循环问题。
人体中，上气路感染通常先于下呼吸道感染(McIntosh et al.，in Virology(Fields和Knipe编)，1045-1074，1990)。传染方式的研究显示，该病毒是经污染物和鼻或眼的自接种而非经悬浮物传播的，表明感染不是于下呼吸道开始的(Hall et al.，J.Pediatr.，99100-103，1981)。病毒感染一般限于呼吸道上皮组织，细胞对细胞扩散或许是经分泌和细胞-细胞融合(McIntosh et al.，inVirology(Fields和Knipe编)，1045-1074，1990)进行的。融合的细胞可以从染病患者的肺吸出物中找到(McIntosh et al.，inVirology(Fields和Knipe编)，1045-1074，1990)，但致病或病毒传播中合胞体形成的重要性尚不知晓。
目前的预防RSV感染的方法没有一种是将注意力集中于防止上呼吸道感染这一起始阶段的。呼吸道这部分中的自然免疫是由鼻分泌物中的IgA抗体介导的。
对RSV感染的免疫应答是短暂的。这使得成年人和儿童出现重复感染。在一项成人激发试验研究中，40％的受试者可由相同的激发菌株在26个月的时期里感染3次(Hall et al.，J.Infect.Dis.163693-698，1991)。多达75％的第一次RSV暴发期间感染的儿童在其第二次暴发中再次感染(Glenzen et al.，Am.J.Dis.Child.140543-546，1986)，虽然初次感染后不常出现重病症。当循环系统抗RSV抗体有足够量存在时，可以是保护性的，但确定其重要性仍有因难。在动物中，非肠道施用的人IgG或特异性的单克隆抗体可以不使此病毒在肺中复制(Walsh et al.，Infect.Immun.43756-758，1984；Taylor et al.，Immunology 52131-142，1984；Prince et al，Pediatr.Infect.Dis.5S201-S203 1986；Tempest et al.，Biotechnology 9266-271，1991)。循环系统内高含量的抗RSV抗体主要保护下呼吸道(Walsh et al.，Infect.Immun.43756-758，1984)。然而，保护免受RSV侵染的分泌抗体的作用尚未搞清，但显现出它可能是上气路免疫力的重要介导物。在用RSV进行激发试验的成年自愿者中，鼻分泌物中的中和抗体的滴度与病毒排出减少和针对该疾病的保护作用相关(Mills et al.，J.Immunol.107123-130，1971；Watt et al.，Vaccine 8231-236，1990)。未成人鼻分泌物中病毒排出的减少也与抗RSV分泌IgA(sIgA)的出现有关(McIntosh et al.，J.Infect.Dis.13824-32，1978)。然而，并非所用的鼻分泌物的中和活性来源于抗体(McIntosh et al.，J.Infect.Dis.13824-32，1978)。鼻抗RSV抗体的水平与保护不受感染或没有重病症之间的相关性尚未在婴儿中得到证实(Hall et al.，J.Infect.Dis.163693-698，1991；McIntosh et al.，J.Infect.Dis.13824-32，1978；Scott et al.，J.Hyg.(Camb)68581-588，1970；Bruhn et al.，Am.J.Dis.Child.131145-148，1977； Kaul et al.，Am.J.Dis.Child.1351013-1016，1981)，但在动物中，粘膜免疫可保护不受鼻感染(Reuman et al.，J.Med.Virol.3267-72，1990；Kanesaki et al.，J.Virol.65657-63，1991)。
RSV是一种有被膜的负链RNA病毒，属于副粘液病毒(Paramyxo-viridae)科的肺病毒(Pneumovirus)属(Fenner，Virology 71371-378，1975；Huang et al.，J.Virol.43，1982)。两个糖蛋白(90 KD和68 KD)暴露于病毒粒子表面。90KD的高度糖基化的G蛋白负责将病毒颗粒结合到靶细胞上(Walsh et al.，J.Gen.Virol.65761-767，1984)。68 KD F蛋白介导病毒被膜与细胞膜融合和合胞体形成(Walsh et al.，J.Gen.Virol.66409-415，1985)。上面所述的F和G表面糖蛋白好象是主要的保护性抗原，核蛋白N和被膜蛋白M2具有较小的保护性活性。中和和抑制融合单克隆抗体业已被确定在F糖蛋白的特定区域(Walsh et al.，Infect，Immun.43756-758，1984；Trudel et al.，J.Gen.Virol.682273-80，1987；Beeler et al.，J.Virol.632941-50，1989；Lopezet al.，J.Virol.64927-30，1990；Paradiso et al.，Vaccine9231-7，1991)。抗G糖蛋白的单克隆抗体比抗F糖蛋白的单抗隆抗体不太可能中和病毒，且不具有抑制融合活性(Norrby et al.，proc.Natl.Acad.Sci.USA 846572-6576，1987；Garcia-Barreno et al.，J.Virol.63925-932，1989；Walsh et al.，J.Gen.Virol.702953-2961，1989)。F糖蛋白的氨基酸顺序在与人感染有关的RSV亚组间有大约90％的保守性(Toms，FEMS Micro-biol.Immunol.76243-256，1991)。保守的抗原决定簇包括一些介导中和和融合抑制的抗原决定簇(Tempest et al.，Biotech-nology 9266-271，1991；Toms，FEMS Microbiol.Immunol.76243-256，1991)。主要引起亚组A和B间差别的G糖蛋白在两亚组间只有53％的保守性(Johnson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 845625-5629，1987)。用表达N或M2的重组疫苗病毒免疫在小鼠中诱导出小的保护性应答(King et al.，J.Virol.612885-2890，1987；Connors et al.，J.Virol.651634-7，1991)。此应答主要归因于CTL活性，因为当被动地给小鼠施用抗N单克隆抗体时不具有保护性(Taylor et al.，Immunology 52137-142，1984)。再则，N业已显示在小鼠和人中是CTL的靶标(King et al.，J.Virol.612885-2890，1987)。
一种由福尔马林灭活、明矾吸收的RSV组成的早期的疫苗，在临床试验中诱导出中和和固定补体的血清抗体。然而，接种疫苗的儿童并未受到保护，并且在随后自然感染中患更严重的下呼吸道疾病(Kapikian et al.，Am.J.Epidemiol 89405-421，1969)。加重疾病的原因尚未得到完全解释。用福尔马林灭活的RSV免疫的棉鼠形成相似的病理应答(Prince et al.，J.Virol，57721-728，1986)，提供了一种测试新疫苗安全性的方法。
过去人们将努力集中在开发减毒的活病毒疫苗上。目前，发现这些疫苗没有效果(Belshe et al.，J.Infect.Dis.145311-319，1982)，未充分减毒(Wright，J.Pediatr.88931-939，1976)，或遗传上不稳定(McIntosh et al.，Pediatr.Res.8689-696，1974；Hodes et al.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1451158-1164，1974)。最近人们将努力集中在RSV表面糖蛋白F和G上。用纯F糖蛋白免疫在棉鼠中已显示出有效性，目前已应用于临床试验(Walsh，J.Infect.Dis.1551198-1024，1987；Routledge，J.Gen.Virol.69293-303，1988；Murphy，Vaccine 8496-502，1990)。然而，一些F糖蛋白制剂业已显示当棉鼠随后RSV感染时引起加重的肺病(Murphy，Vaccine 8497-502，1990)。将产生于杆状病毒表达体系中的重组嵌合体FG糖蛋白非肠道给药时，在棉鼠中诱导出保护性免疫应答(Brideau et al.，J.Virol.702637-44，1989)。与单独用F糖蛋白一样，该FG疫苗也显示引起一些加重的肺病(Wathen et al.，J.Infect.Dis.163477-82，1991；Connors et al.，Vaccine 10475-484，1992)。表达F、G或M2被膜蛋白、或核蛋白N的重组疫苗病毒业已在几个动物模型中测试。F和G重组物已显示最有希望，它们在小鼠(Scott et al.，J.Virol.60607-613，1986；Olmsted et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 837462-7466，1986)，棉鼠(Elango et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 831906-1910，1986)，和鹰面猴(Olmsted etal.，Vaccine 6519-524，1988)诱导出保护性免疫。然而，在黑猩猩中应答显著偏低(Collins et al.，Vaccine 8164-8，1990)。将腺病毒用作表达RSV F糖蛋白的载体也作了试验(Hsu et al.，Vaccines 91，1991)。
由此，需要一种防止RSV疾病的有效方法。本发明探索满足此需求。
一方面，本发明提供了对呼吸道合胞体病毒(RSV)中和的单克隆IgA抗体，例如HNK 20，它针对例如RSV的F糖蛋白。优选地，该单克隆抗体是基本上纯的形式，不含其它的免疫物质。
另一方面，本发明提供含有一种或多种单克隆IgA抗体和合适载体或稀释剂的组合物。
本发明另外提供一种治疗或防止RSV在宿主中感染的方法，该方法包括给宿主施用足以达到治疗或防止疾病量的本发明抗体。该抗体可以非肠道给药于宿主，例如，静脉给药，或可以给药于宿主的粘膜表面。优选的给药方式是鼻内给药。
在另一方面，本发明的特点在于，使用对呼吸道合胞体病毒的单克隆IgA抗体，来制备治疗或防止呼吸道合胞体病毒在宿主中感染的药物。
本发明也提供适合治疗或防止RSV感染的含有效量的本发明抗体和药物上可接受载体或稀释剂的药物组合物。
本发明也提供生产针对RSV的单克隆IgA抗体(例如HNK 20)的方法，其中培育表达该单克隆抗体(例如HNK20)的杂交瘤细胞系，回收由此产生的抗体。该方法优选通过在营养培养基中体外培育细胞系并从培养物上清液中收集抗体来进行。
本发明也提供诊断RSV抗原在生物试样中存在的方法，该方法中，将抗原与本发明的单克隆IgA抗体(例如HNK20)接触，并且抗原的存在由免疫检测方法测定，例如，免疫荧光显微镜检查法，免疫电子显微镜检查法，固相辐射测定，或酶连免疫测定(ELISA)。该方法优选如下进行将取自人或动物的样本与结合到固体支持物上的抗体一起培育，洗涤固体支持物，并将之与作为示踪物的放射性标记或酶标记抗体一起培育。该试样可以是，例如，鼻分泌物，血清，鼻洗涤液，咽分泌物，或支气管分泌物。
本发明另外提供一种将RSV抗原从生物试样分离的方法，该方法包括，将试样与本发明抗体接触(该抗体结合于固体支持物上)，以使RSV抗原结合到该抗体上，并随后将该RSV抗原从固体支持物上分离。
本发明另外提供一种含有两个容器的试剂盒，第一个容器含有由本发明抗体涂敷的塑料底物，第二个容器含有已连有放射标记物或酶标记物的本发明抗体。优选，该塑料底物是珠、棒或管形的聚苯乙烯。
另一方面，本发明提供一种分泌针对RSV抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞系(例如HNK 20)。该细胞系优选是基本上纯的形式，无其它的细胞物质。
在本发明也提供了含有该细胞系的组合物，该组合物含有该细胞系及能维持该细胞系的营养培养基。适宜的培养基含有碳源，氮源，且如果需要，还含有维生素和/或有机盐。
另一方面，本发明提供了一种繁殖本发明杂交瘤细胞系(例如HNK20)的方法，包括将此细胞在营养培养基中培育。繁殖方法也代表生产可以从培养基分离的本发明抗体的方法。优选，本发明杂交瘤细胞系的繁殖是体外进行的，其中该细胞系是在营养培养基中培育的。本发明细胞的适宜的营养培养基含有碳源、氮源和如果需要，还含有维生素和/或无机盐。例如，可以使用补有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基。另一种合适的培养基是Sigma无血清和无蛋白杂交瘤培养基。
本发明抗体的一个重要优点是它可以减少上气路的感染，其中IgA是主要效应抗体同种型。当抗体鼻内施用时，获得的结果特别好。这是本发明抗体区别于其它非肠道给药(经静脉或粘膜内途径)以减少下呼吸道感染，而让上呼吸道感染出现的其它单克隆抗体或免疫球蛋白制剂的特点。本发明的单克隆抗体特别适用于被动治疗和保护住院病人，特别是婴幼儿免受RSV侵染，而与此同时抑制爆发时期病毒的蔓延。
如前面提到的，鼻内途径给药优于非肠道途径，因为鼻内途径具有更安全的优点。对局部(鼻内)抗体的敏感性副反应仅位于鼻或上气路而非全身性的过敏反应，全身性过敏反应对宿主可有严重的后果。免疫蛋白(IVIG)或单克隆抗体的非肠道给药会造成对受药者潜在不利作用的抗个体基因型抗体应答。保护所需的鼻内抗体浓度明显低(低200倍)于非肠道抗体所需的浓度。婴幼儿或许不能耐受保护所需的大量(容量)IVIG。最后，局部施用的IgA还可能优于IgG，因为它可以是多价的而非单价的，且因此在结合或中和病毒上更有效。而且，与IgG相比，IgA与补体结合程度非常有限，其结果是IgA不大可能参与炎症反应，该反应可能在被治疗的个体中引起副作用。
附图描述

图1是来自生长于无蛋白培养基中的杂交瘤细胞的抗RSV HNK单克隆抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。
图2显示在RSV攻击前1小时给小鼠鼻内施用渐增剂量的HNK 20的效果(由不成对t检验求得的显著性0.1μg，P＝.03；1μg，P＝0.001；10μg，P＝.001；100μg，P＝0.001)。
图3显示RSV攻击前1小时用单克隆IgA(HNK 20和2D6)鼻内处理小鼠的结果(由不成对t检验求得的显著性，肺，P＝.02，鼻甲，P＝.01)。
图4显示RSV攻击前1至3天用HNK 20鼻内处理小鼠的结果(由不成对t检验求得的显著性24小时，P＝.02；48小时，P＝.03；72小时，P＝.03)。
图5是用由细胞系HNK 18、HNK 20、133/1H(抗F)、和2D6(抗霍乱弧菌)产生的单克隆抗体免疫沉淀的35S-标记RSV-感染溶胞产物的SDS-PAGE分析。
图6是HNK 20IgA在非还原性5-15％梯度SDS-PAGE凝胶(该凝胶是印迹在硝酸纤维素膜上并与碱性磷酸酶标记的兔抗鼠IgA-α链特异性抗体反应)上电泳后进行的免疫印迹。
杂交瘤细胞系是通过鼻内或胃内释放活RSV来免疫BALB/c小鼠而制备的。为优先诱导粘膜IgA应答，进行粘膜免疫。终免疫四天后，将小鼠杀死，分离出肺和派伊尔氏淋巴集结白细胞，并分别与P3U1骨髓瘤细胞融合。所得的杂交瘤由ELISA筛选抗RSV抗体的产生。肺细胞融合体产生24个分泌抗RSV抗体的杂交瘤细胞。融合是根据kohler等的方法进行的(Eur.J.Immunol 6292-295，1976)。这些抗体中有8种是IgA亚型。未从派伊尔氏淋巴集结融合细胞中得到抗RSV杂交瘤细胞。
在鉴定和克隆后，检测抗RSV单克隆抗体对RSV亚组A和B的识别。对RSV亚组A(菌株A2和Long)和亚组B(菌株18537)的结合由ELISA作比较。结果示于下表1。
表1 单克隆抗体与RSV菌株A2(亚组A)、Long(亚组A)和18537(亚组B)的结合实验R0265AOD405单克隆抗体A2(A)Long(A) 18357(B)HNK 40.2140.162 0.009HNK 10 0.0540.044 0.053HNK 11 0.1410.123 0.146HNK 12 0.0310.021 0.056HNK 13 0.0260.004 0.009HNK 16 0.5400.598 0.579HNK 17 0.1760.176 0.066HNK 18 0.3560.423 0.374HNK 19 0.1510.204 0.137
实验R0298AOD405单克隆抗体A2(A)Long(A) 18357(B)HNK 20 0.1910.227 0.146HNK 21 0.2500.295 0.248HNK 22 0.1220.205 0.062HNK 23 0.0810.186 0.026HNK 24 0.2300.258 0.203发现八种IgA中有五种(HNK 11，19，20，22和24)与所有三种菌株结合。这五种单克隆抗体，加上三种亚组交叉反应性IgG2a单克隆抗体(HNK 16，18和21)被选用作进一步研究。将这八种交互反应性杂交瘤在无蛋白培养基中进行适应生长。收集此培养基，浓缩，并作抗体浓度测定。图1显示各浓缩抗体制剂的SDS-PAGE分析。为显现蛋白质用考马斯蓝将凝胶着色。
将上述抗RSV单克隆抗体通过采用菌株A2的斑减少测定来测试体外中和作用(参见表2)。两种抗体，HNK 20和HNK 24，显示中和活性。HNK 20最有效，在0.1μg/ml浓度或更低时可有50％的斑数减少。HNK 20的50％效应剂量与亚组B菌株18537的中和作用相同。
表2体外中和RSV单克隆抗体同种型 中和aHNK 11IgA＞100μg/mlHNK 19IgA＞100μg/mlHNK 20IgA 0.1μg/mlHNK 22IgA＞100μg/mlHNK 24IgA 10μg/mlHNK 16IgG2a ＞100μg/mlHNK 18IgG2a ＞100μg/mlHNK 21IgG2a ＞100μg/mla给出50％斑减少的最低抗体浓度表2显示没有一种IgG单克隆抗体中和此病毒。
业已对上述八种抗RSV单克隆抗体在小鼠模型中作了保护免受肺RSV感染的筛选。在小鼠鼻内施用抗RSV或非特异性对照单克隆抗体(2D6-一种抗霍乱弧菌的IgA)后24小时，用大约106空斑形成单位(PFU)的病毒进行改击。四天后，取出肺并匀浆化，测定肺组织的病毒含量。结果示于表3。
表3体内保护实验RSV攻击前24小时用单克隆抗体鼻内处理后肺病毒滴度的减少实验编号处理 肺PFU/g(x105)1 2D6 1.8±0.1HNK 16(IgG) 1.4±0.4HNK 18(IgG) 0.3±0.1HNK 21(IgG) 0.7±0.12 2D6 0.9±0.2HNK 11(IgA) 1.0±0.3HNK 19(IgA) 0.6±0.2HNK 22(IgA) 0.7±0.23 2D6 1.1±0.3HNK 20(IgA) 0.02±0.024 2D6 0.7±0.4HNK 24(IgA) 0.3±0.1用单克隆抗体HNK 18(一种IgG抗体)和HNK 20(一种IgA抗体)处理导致肺中病毒滴度减少大约1个对数值或更多。
对一定浓度范围的抗体HNK 20作了测试，测试其保护小鼠肺不受感染的能力。结果示于图2。HNK 20抗体是在病毒攻击前1小时鼻内施用。在每鼠1和10μg之间的剂量时具有最大的保护性。
HNK 20单克隆抗体使RSV不在鼻粘膜中复制。这由图3中给出的数据证实。如上所述攻击小鼠，攻击后四天，测定鼻甲组织的PFU/g值。在病毒攻击前1小时施用HNK 20或2D6单克隆IgA。HNK 20在鼻组织中产生了大于1个对数值的病毒PFU减少。
病毒攻击前1小时或24小时前施用HNK 20抗体对小鼠肺不受感染的保护是相似的。图4显示，在攻击前24、48和72小时鼻内施用HNK 20时对小鼠的肺保护作用。在所有三个时间点上均可见到保护性，攻击前24小时处理小鼠的保护作用比在48和72小时处理的要好。
HNK 20也对棉鼠作了保护性活性测试。棉鼠是一完善建立的呼吸道RSV感染的模型。在RSV攻击前1小时、3小时和6小时鼻内施用HNK 20。感染后4天将棉鼠杀死，并测定肺匀浆和鼻洗涤液中RSV的滴度。在所有三个时间点均观察到对肺和鼻组织的显著保护作用(参见表4)。许多HNK 20处理的棉鼠，特别是在1小时时处理的，没有可回收到的病毒。
表41. +4天时的鼻洗涤液滴度
0＝未测出(小于最小可测滴度[＜1.3 log10/]0.5ml])HulSG＝人免疫血清球蛋白(Armour Pharmaceuticals)IgA＝OraVax IgA单克隆抗体(Mab)1、+4天时肺中RSV滴度
0＝未测出(小于最小可测滴度[＜1.3 log10/g肺])HulSG＝人免疫血清球蛋白(Armour Pharmaceuticals)IgA-OraVax IgA单克隆抗体(Mab)
HNK 18和HNK 20的蛋白特异性已用来自RSV感染的VERO细胞的放射性标记胞溶物的免疫沉淀进行测定。HNK 20沉淀一对与F糖蛋白的F1和F2亚单位移动率相应的带。这点显示于图5中。与这些带共迁移的带有由133/1H沉淀的带，133/1H是一种已证明可结合到F糖蛋白上的单克隆抗体。HNK 18沉淀一分子量大约47 KD的蛋白质。此带的身份尚未得到鉴定，但其分子量接近N蛋白(43.5 KD)的分子量。进一步的HNK 20的F糖蛋白特异性的证据由ELISA提供。在此方法中，显示出该单克隆抗体结合到用表达RSV F糖蛋白的重组疫苗病毒感染的VERO细胞。这点显示于表5中。与未感染的VERO或与用重组病毒感染的表达糖蛋白G或肝炎VP59的VERO细胞的结合可以忽略不计。
表5单克隆抗体与重组病毒感染的表达RSV F，RSV G，或肝炎VP59的VERO细胞的结合
*抗RSV单克隆抗体(从Biodesign International获取)结构上，通过采用轻链特异性抗体的ELISA显示出HNK 20具有k轻链。HNK 20的聚合结构是通过在非还原条件下将该单抗隆抗体在5-15％梯度丙烯酰胺凝胶上分级分离，并用免疫印迹将IgA带显色来测定的。这点示于图6中。该抗体显示出以单体、二聚体和更高的聚合体形式产生。主要的种类是二聚体。
研究表明，HNK 20抗体在各种条件下表现出良好的贮存特性。由此，由结合RSV的ELISA和还原和非还原条件下的凝胶电脉测定在各种条件下贮存1至2个月的HNK 20抗体。已证实此抗体在4℃、-80℃、或-20℃下的甘油中非常稳定。在二个月时间点在-80℃或-20℃贮存的样本中发现ELISA反应性略有降低和出现较低分子量带。
分泌单克隆抗体HNK 20 mAb的细胞系HNK 20已于1993年7月1日在美国典型培养物保藏中心(ATCC，12301 Parklawn Drive，Rock-Ville，Maryland 20852，USA)保藏，保藏号ATCC HB 11394。
由杂交瘤HNK 20分泌的单克隆抗体可从小鼠腹水中回收到。繁殖此细胞系和生产此抗体的方法代表本发明的另一方面。这种得到本发明抗体的方法具有优点，其产率可以(例如)比该细胞的大规模培养获得的产率大10倍。进行此方法通常历时约2至3周。
由HNK 20杂交瘤分泌的单克隆抗体也可以通过在空心纤维生物反应器(如由Endotronics，Inc.生产的Maximizer 1000)中培养该杂交瘤细胞，高浓度和高纯度地进行生产。这种获得本发明单克隆抗体的方法可比在小鼠腹水中生产抗体有更高的产率(约1mg/ml)和更高的纯度。
本发明的抗体可由上述来源不经纯化即可使用。然而，优选抗体在使用前进行纯化。例如，如前所述，IgA单克隆抗体可以通过在Q琼脂糖上顺序阴离子交换层析，接着采用Sephacryl S-300凝胶过滤，从细胞培养液中纯化(Soman et al.，J.Immunol.150116A，1993)。
本发明的单克隆抗体，例如由细胞系HNK 20产生的那些，在患RSV感染或暴露于RSV的患者的被动治疗上具有特别的实用性。已知人、黑猩猩和牛是RSV的天然宿主。此外，除人以外的灵长类，包括卷尾候(cebus)和鹰面猴，当被RSV感染时形成临床疾病。然而，RSV是在成年白鼬的上呼吸道和羊的肺中复制的。最近的研究绝大部分是采用棉鼠或小鼠作模型，研究RSV致病机理和保护不受RSV感染。RSV在这些物种的上和下呼吸道中复制，4或5天后病毒滴度出现峰值。这些啮齿动物特别适用于证实抗RSV的保护作用的免疫学研究。用IgG被动免疫的研究已显示，由啮齿动物得到的结果可预示IgG在猴和人中的活性。由此人们相信，小鼠和棉鼠模型中得到的本发明IgA单克隆抗体的结果可预示在人、包括未成年人中的可能效力。
根据本发明的一个方面，该单克隆抗体可以用来被动治疗或防止RSV感染宿主，包括人。该方法包括向患者施用有效量的HNK 20。一般来说，该抗体被施于粘膜表面，且可以口服或鼻内给药。施用的抗体量可在50μg/kg至5mg/kg体重的范围内。
对于治疗和/或预防应用，本发明抗体组合物可以是带有适合的药物载体和/或本领域已知的稀释剂的固体或液体形式。该组合物用常规方式制备且包含有效量的抗体，典型地是50μg/kg至5mg/kg体重。
该组合物可以是可注射用溶液，或是溶液、悬浮剂、或粉剂形式。优选，该组合物被配制成提供上呼吸道保护的鼻释放剂，或提供下呼吸道保护的气雾释放剂。
由本发明的细胞系(例如HNK 20)产生的抗体，在筛选被RSV感染的患者的试验中也具有实用性。该抗体可以用在采用(例如)免疫萤光显微镜检查法或免疫电子显微镜检查法以测定细胞物质或细胞分泌物中RSV存在的测定体系中。定量测定可以通过固相辐射测量测定(Solid phase radiometric assay)或ELISA进行。
根据本发明的诊断生物样本中RSV抗原存在的方法包括将抗原与抗RSV的单克隆IgA抗体(例如，由杂交瘤细胞系HNK 20分泌的那些)接触，并通过免疫萤光显微镜检测法，免疫电子显微镜检测法，固相辐射测量测定系统，或在酶连免疫测定中，检测RSV抗原的存在。优选，将来源于人或动物的样本用IgA抗体(例如HNK 20)在固相中培育，接着洗涤和用放射标记的或酶标记的IgA抗体作示踪剂进行培育。在测定体系中，优选的固相包含抗体涂敷于其上的塑料或玻璃底物。特别优选的底物是由例如聚苯乙烯制作的珠、棒、管或板。
本发明在诊断试剂盒中也提供这些涂敷底物，例如珠。该试剂盒包含两个容器，第一个容器含有涂敷有抗RSV的IgA抗体(例如HNK20)的塑料或玻璃底物(如珠、棒、板、或管)，第二个容器含有连有放射标记物的抗RSV的IgA抗体(例如HNK 20)。
在根据本发明的另外的测定方法中，可以采用通常要与抗RSV的IgA抗体相连的(例如)酶标记物或生物素标记物，来代替采用放射标记物。RSV感染的诊断是通过将临床样品(含RSV)与涂敷有针对RSV的IgA抗体的底物反应来进行的。合适的培养期后，加入第二(放射或酶标记抗体)抗体(在酶标记抗体的情况下接着加底物)。反应测定在临床样品中RSV抗原的存在量。
当偶联于固相如溴化物活化的葡聚糖时，本发明的单克隆抗体也可用来将RSV从人或动物生物材料中除出，或是为了制备纯化的RSV用于制备疫苗，或是为了将RSV从将被施用于患者的生物材料中除出。因此本发明提供了一种将RSV抗原用结合于固相的针对RSV的IgA抗体从生物材料中分离出来的方法，将该抗原与抗体结合，然后将所需的已纯化的材料从固相中分离出来。
HNK 20杂交瘤可以用来构建含有小鼠和人序列的新抗体。将来自抗RSV IgA抗体(例如HNK 20)的IgA重和轻链可变区，采用重组DNA技术，与人免疫球蛋白重和轻链恒定区组合，以产生主要为人序列并具有针对RSV的小鼠单克隆IgA抗体(例如HNK 20)的结合特异性的抗体。这类抗体，称作嵌合或人化抗体，特别适用于人的非肠道治疗，因为它们不大可能激起针对此抗体的免疫或过敏应答。
本发明的单克隆IgA抗体可以结合到分泌组分上，以产生对蛋白酶消化的抗性增强了的复合物。分泌组分以几种方式之一与聚合IgA结合。在一种方法中，IgA抗体和分泌组分在溶液中混合，并让其缔合。在另一方法中，将分泌IgA的杂交瘤细胞用含有分泌组分的cDNA的表达载体转染。所得细胞产生IgA分泌组分复合物。在第三种方法中，将一种培养的上皮细胞系(如MDCK)用含有聚合免疫球蛋白受体的cDNA的表达载体转染。将转染的上皮细胞在一个小室中生长于一个透性滤膜上，其中浸泡细胞顶部和底部的培养基是分开的。聚合免疫球蛋白受体使IgA从底面培养基向顶部培养基转移。将聚合IgA加入底面培养基，而IgA被释放入顶部培养基，从而与分泌组分(聚合免疫球蛋白受体的裂解片段)结合。
实施例本发明由下列非限定性实施例作进一步的说明。
实施例1在异氟烷麻醉下，将三只小鼠用25μl体积的106PFU RSV鼻内感染。四天后，取出鼻甲，并制备在组织培养基中合并的10％鼻组织匀浆。该样本用空斑测定滴定，稀释至106PFU/25μl，并接种于另一组3只小鼠。继续进行病原体培养。小鼠适应性变化后，观察到肺中病毒滴度明显增高。接种后3，4，5和6天测试病毒量以确定病毒复制的峰值。将这些实验确定的最佳条件用于所有随后的小鼠激发实验。
实施例2病毒激发前一或几小时，通过鼻内施用不同量的单克隆抗体，测试保护所需的抗RSV抗体(例如HNK 20)的量。在异氟烷麻醉下，以25μl的容量鼻内给予每只鼠0.1至100μg范围量的该抗体。
为进行动物实验，生产大约50mg的单克隆IgA抗体。这些抗体被部分地纯化并加工产生抗RSV IgA抗体(例如HNK 20)的单体和多聚体成分。将此杂交瘤(例如HNK 20)克隆3次，并在无蛋白培养基(Sigma Chemical Company)中适应生长。该杂交瘤是在四个500ml的旋转(Spinner)烧瓶中生长的，每2天收集2L用过的培养基。收集总量为8L。用截止在100 KD的膜在搅拌的容器中将此培养基浓缩约200倍。所得的粗浓缩物含有约50％即约2-5mg/ml纯单克隆抗体。
单克隆抗体IgA(例如HNK 20)流经DEAE琼脂糖柱，并用0.3M氯化钠洗脱。此材料IgA含量大于90％，并用Sephacryl S300筛分排阻色谱分离成单、聚合和聚集组分。分子量由HPLC分析和采用5至15％梯度凝胶的SDS-PAGE来测定。实施例3当对RSV的单克隆IgA抗体(例如HNK 20)释放入粘膜或生物粘合载体时，测定该抗体所提供的保护期间。被测试的载体包括甲基纤维素和中和的聚丙烯酸。制备出0.25％甲基纤维素中50μg/ml抗体的溶液，或1.5％聚丙烯酸中5μg/ml抗体的溶液。用鼻内滴注10μl抗体载体混合物来处理小鼠。对照小鼠接受盐水中的非特异性单克隆IgA 2D6，与载体混合的2D6，或盐水中的抗RSV单克隆IgA抗体(例如HNK 20)。不同组的小鼠在处理后1小时、5小时、10小时或15小时用RSV鼻内攻击。攻击四天后，将小鼠杀死，并测定鼻内的RSV滴度。将保护时间长的载体进一步检测其保护作用的剂量效应和负作用。
权利要求
1.一种针对呼吸道合胞体病毒的单克隆IgA抗体。
2.一种组合物，包含权利要求1的单克隆IgA抗体和一种载体或稀释剂。
3.针对呼吸道合胞体病毒的单克隆IgA抗体的应用，用于制备一种治疗或预防呼吸道合胞体病毒在宿主中感染的药物。
4.一种检测呼吸道合胞体病毒抗原在生物试样中存在的方法，所述方法包含下列步骤(a)将所述样品与针对呼吸道合胞体病毒的单克隆IgA抗体接触；和(b)通过免疫测定检测所述试样中所述抗原的存在。
5.权利要求4的方法，其中所述的免疫测定是免疫萤光显微镜检查法、免疫电子显微镜检查法、固相放射测量测定、或酶连免疫测定。
6.一种将呼吸道合胞体病毒抗原从生物试样中分离的方法，包含下列步骤(a)将所述试样与针对呼吸道合胞体病毒的抗体接触，所述抗体结合于固体支持物上；和(b)将所述抗原从所述固相分离出来。
7.一种试剂盒，包含(a)第一个容器，含有用针对呼吸道合胞体病毒的抗体涂敷的塑料底物；和(b)第二个容器，含有针对呼吸道合胞体病毒的抗体，此抗体已连接放射标记物或酶标记物。
8.权利要求7的试剂盒，其中该塑料底物是珠、棒、管或板形的聚苯乙烯。
9.一种产生针对呼吸道合胞体病毒的单克隆IgA抗体的杂交瘤细胞系。
10.一种组合物，包含产生针对呼吸道合胞体病毒的单克隆IgA抗体的杂交瘤细胞系和能维持此细胞系的营养培养基。
11.权利要求1的单克隆抗体，其中所述的抗体由杂交瘤细胞系HNK 20产生。
12.权利要求3的应用，其中所述的单克隆IgA抗体由杂交瘤细胞系HNK 20产生。
13.权利要求4的方法，其中所述的单克隆IgA抗体由杂交瘤细胞系HNK 20产生。
14.权利要求6的方法，其中所述的单克隆IgA抗体由杂交瘤细胞系HNK 20产生。
15.权利要求7的试剂盒，其中所述的单克隆IgA抗体由杂交瘤细胞系HNK 20产生。
16.权利要求9的杂交瘤细胞系，其中所述的杂交瘤细胞系是HNK 20。
17.权利要求10的组合物，其中所述的杂交瘤细胞系是HNK 20。
全文摘要
本发明涉及针对呼吸道合胞体病毒(RSV)的抗体，和产生该抗体的杂交瘤细胞系(例如HNK20)。该抗体可用来预防或治疗RSV感染和疾病，以及用于诊断RSV感染的方法。
文档编号G01N33/569GK1132516SQ94193595
公开日1996年10月2日 申请日期1994年8月1日 优先权日1993年7月30日
发明者理查德·A·韦尔 申请人:奥拉维克斯公司