专利名称：细胞电位测定装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及在所谓电神经生理研究领域中使用的那种测定伴随神经细胞活动所产生的电位变化的细胞电位测定装置。
近年来，对神经细胞的医学研讨和适用电元件的可能性的研讨活动日益频繁。在神经细胞活动时会产生活动电位。该细胞活动电位是因神经细胞的离子渗透性变化而引起细胞膜内外的离子浓度变化、并随着上述的离子浓度的变化又引起的细胞膜电位的变化而产生的。这样，通过用电极测定由神经细胞附近的离子浓度变化(即离子电流)所产生的电位变化，便可检测神经细胞的活动情况。
为了测定上述因细胞活动产生的电位，例如可以通过将玻璃制的细胞外电位测定用电极插入细胞中完成测定。在测定因刺激产生的感应电位时，需将记录用玻璃电极与刺激用金属电极同时插入然而，由于采用这种插入电极的方式进行测定时会损伤细胞，所以难以保持长时间的测定。而且，在对若干个位置同时进行测定时，还存在有空间限制和位置精度方面的问题为此，本发明人已发明了在绝缘基板上利用导电物质制作的若干个微电极和引出电极用导电图形、并在该导电图形上可进行细胞培养的一体化复合电极(参见特开平6-78889号公报和特开平6-296595号公报)。若采用该一体化复合电极，可以不受空间的制约而在狭小间隔的若干个位置上同时测定电位变化，并且可以长时间的测定。
然而，目前人们渴望设计出一种能充分利用该一体化复合电极，在精确和高效率完成测定的同时还对测定结果进行整理的测定装置，或称测定系统。本发明的目的就是要提供这种迫切需要的细胞电位测定装置。
本发明的细胞电位测定装置的特征在于，它装置有A一体化细胞放置器，该细胞放置器的基板上配置有若干个微电极，放置在这些电极上的用于放置细胞的细胞放置单元，以及用于向上述微电极供给电信号的同时由上述微电极传导出电信号的电连接组件，B刺激信号供给组件，它与上述一体化细胞放置器的电连接组件相连接并用于向上述细胞供给电刺激，C信号处理组件，它用于处理由上述细胞的电生理活动所产生的输出信号，并与上述细胞放置器的电连接组件相连接。
最好是还配置有用于观察上述细胞光学特性的光学观察组件，以及用于将设置在上述一体化细胞放置器上的使细胞保持在培养气氛中的细胞培养器件，从而可以保持长时间的测定。
有关其它的更可取的结构和作用，将在后面说明。
下面举例概括说明具有上述结构的本发明装置的测定步骤。将样品即细胞放置在一体化细胞放置的细胞放置单元中，并使该细胞与若干个微电极相接触。边观察由光学观察组件获得的细胞的象，边通过电连接组件由刺激信号供给组件向若干个微电极中任一对电极间提供刺激信号。由其它各电极获得的感应电位随时间的变化经过电连接组件馈入信号处理组件，并将经过必要的信号处理后输出给显示装置等。当然，也可以同样进行不加刺激信号的自发电位的测定。
由于上述的细胞电化学的测定必需在活着的细胞上进行，所以通常要在一体化细胞放置单元上配置培养细胞的培养基。一体化细胞放置器相对于测定装置是可自由拆装的，以便可以将一体化细胞放置器放入常规的细胞培养器中进行细胞培养，在测定时将一体化细胞放置器由细胞培养器中取出，再放置在测定装置中，如果装备有用于将一体化细胞放置器上的细胞保持在培养气氛中的细胞培养件，就可以保持长时间的测定。该细胞培养组件，是由使温度保持一定的温度调节组件，使培养液循环的组件，以及供给空气和二氧化碳的混合气体(例如含CO25％)用的组件构成的。
上述一体化细胞放置器的结构最好包括在玻璃板上成矩阵状(格状)的若干微电极，引出这些微电极用的导电图形，与这些导电图形的端部相连接的电连接点，以及覆盖在上述导电图形表面上的绝缘掩膜，在包括有上述若干个微电极的区域上还配置上述细胞放置单元。利用透明玻璃板作基板，可以容易地对细胞进行光学观察。而且，导电图形和绝缘掩膜也最好基本上是透明的或半透明的。把若干微电极配置成矩阵状可以易于指定供给刺激信号的电极和检测由细胞活动产生的电压信号的电极的位置。例如，最好按8行8列配置64个微电极。若从使表面电阻尽可能的小，进而提高检测灵敏度这点考虑，各电极的表面积应作得大一些，但从电极间隔的制约和测定分辨率等角度考虑，使其在4×102-4×104平方微米的范围内较合适。
上述电连接组件最好包含有具有与上述电连接点相接触的接触组件并可以上下侧夹持固定位上述玻璃板的两个开槽的夹具，利用这种结构，可方便而可靠地固定住上述玻璃板和向微电极外侧引出容易和可靠。此外，在固定上述夹具的同时，最好还把具有通过接线端子连接的外部连接导电图形的印刷电路配线板安装在上述的夹具接触件上，借此，可更容易地与外部设备，例如刺激信号供给单元和信号处理单元等相连接。为了不使刺激信号和检测信号产生过大的衰减和畸变，最好使上述连接点与上述接触组件间的接触电阻，和上述接触组件与上述接线端子间的接触电阻均在30毫欧以下。
上述光学观察组件最好由光学显微镜与其相连接的摄象装置和图象显示装置组成。这样，通过把经显微镜放大后的细胞的象，由摄象装置(视频摄象机)摄象后显示在图象显示装置(高精细度显示器)上，便可以很容易地进行通过目视观察测定细胞和电极位置，如果在光学观察组件中还安装图象存储单元，以便方便地对测定数据进行记录操作，则更是可取的。
通过用脉冲信号发生器作为上述刺激信号供给组件，便可以对细胞供给作为刺激信号的多种类型的信号波形。如果使上述信号处理单元中还安装有用于放大由上述细胞活动产生的检测信号的多通道放大器和用于实时显示放大了的信号波形的多通道显示装置，以便能同时显示由若干电极获得的信号波形(细胞电位随时间的变化)，则更为可取。
另一方面，如果再安装一个通过D/A转换器输出刺激信号的同时能处理通过A/D转换器输入的由上述细胞电生理活动产生的输出信号的计算机则更加可取，利用该计算机还可以在画面上设定任意波形的刺激信号，不仅可以在画面上显示检测信号的波形，而且可以进行各种处理显示，且还可以方便地将信号输出给绘图仪或存储起来。另外，还可以用该计算机对上述光学观察组件和上述细胞培养组件进行控制。
图1为使用在本发明一实施例所涉及的细胞电位测定装置中的一体化细胞放置器的斜视图。
图2为一体化细胞放置器的组装图。
图3为表示设置在构成一体化细胞放置器的一体化复合电极中央部位的64个微电极及引出电极用导电图形的平面图。
图4为一体化复合电极剖面模式的示意图。
图5为上部和下部夹具呈夹持固定一体化复合电极状态的示意性平面图和侧剖视图。
图6为图5中一体化复合电极和上下夹具的斜视图。
图7为配置在上夹具上的接触组件的侧视图。
图8为沿与图2相反方向观察的一体化细胞放置器的组装图。
图9为本发明一实施例所涉及的细胞电位测定装置结构的方框图。
图10为对采用在本发明装置中使用的一体化细胞放置器测定的由培养的细胞活动所产生的电压波形，与采用原有的通用玻璃电极(细胞外电位测定用电极)测定的电压波形进行比较的一个实例的示意性说明图。
图11为采用本发明装置测定培养细胞自发电位测定结果的示意性说明图。
图12为采用本发明的装置测定的培养细胞的感应电位测定结果的示意性说明图。
在各图中的标号为1.一体化细胞放置器2.一体化复合电极3.上夹具4.下夹具5.印刷电路配线板11.微电极12.导电图形20.光学观察组件21.倒立显微镜22.SIT摄象机24.图象存储单元30.计算机31.A/D转换器32.D/A转换器33.去耦器34.多通道放大器40.细胞培养组件下面参考
本发明的实施例。
首先说明本测定装置所使用的一体化细胞放置器。图1和图2分别示出了该一体化细胞放置器1，它包括由设置在玻璃板上的若干个微电极和由此引出的导电图形带构成的一体化复合电极2，在其上下两侧将其夹持固定用的两个分开的夹具3、4，以及固定在该夹具上的印刷配线板5。
该一体化复合电极，可与由特开平6-7889号公报等公开的电极基本上相同。即可在厚1.1毫米，长50毫米的四方形透明硼硅玻璃制成的基板的中央部位上形成呈8×8矩阵状的64个微电极11，在各微电极上连接有引出用导电图形(参见图3)。各电极11形状为边长50微米正方形(面积为25×102μm2)，且相邻电极的中心间距为450微米。在基板的四边上，分别形成有16个、总计为64个的电连接点7(参见图2)，这些电连接点分别按与基板中央部分的64个微电极呈一一对应关系的引出用导电图形相连接。下面参考图4的剖面图，说明该一体化复合电极2的制造方法。为清楚起见，图4中的各部件的比例尺是各不相同的。
在玻璃板13的表面上涂复150nm厚的ITO(氧化铟和氧化锡混合物)膜，以便用光致抗蚀剂和蚀刻法形成导电图形12、在其上涂复一层1.4微米厚的聚酰亚胺非光敏膜，以形成类似的绝缘掩膜14。在微电极及电连接点部分暴露出ITO膜，在该部分上涂复500nm厚的镀镍层15和500nm厚的镀金层16。用聚硅酮型粘接剂，将内径为22mm、外径为26mm、高为8mm的圆筒状聚乙烯框体6(参见图2)，通过导电图形6和绝缘掩膜9粘在玻璃板上。将该聚苯乙烯圆筒状框体在使中心与玻璃板的中心，即64个微电极的中心部分相重合的状态下固定，使该聚苯乙烯框体的内侧相当于细胞放置单元。在该聚苯乙烯框体内充满含重量百分比为1％的铂氯酸、0.01％的醋酸铅、0.0025％的盐酸水溶液，使20MA/Cm2的电流通过1分钟，以便在微电极部分的镀金表面上析出铂黑11a。
下面说明在一体化复合电极2的上下两侧将其夹持固定的两个开口夹具3、4。夹具3、4由树脂制成，且如图2所示，具有由用于夹持一体化复合电极2边缘部的台阶部分和矩形开口构成的中央部分。在上夹具3上安装一对固定用的部件8和16个×4组的接触部件9。夹持固定着一体化复合电极2的夹具3、4的顶视图如图5(A)所示，侧视图(B-B剖面图)如图5(B)所示，其里侧的斜视图如图6所示。从这些图中还可以看出，固定部件8是靠枢轴支承在位于上夹具3相对的两侧边上的轴销8a上的。而且，在下夹具4内侧的两相对边上，还形成有沟槽4a，以便通过使固定部件8上的凸条8b能够嵌在该沟槽中而使上下夹具3、4在夹持住一体化复合电极2的状态下牢固的固定。
在上夹具3上设有与一体化复合电极2的电连接点7相对应的64个接触部件9，它们是由上面镀过镍和金膜的铍铜等富有弹性的良导体金属板加工而成的，且具有如图7所示的形状。即针部分9a和基部9b，是由该基部9b通过弯曲部9c伸延至可动接触部9d的。通过采用这种结构，可动接触部9d可相对于9b发生弹性变形。上夹具3还在64(16×4)个位置处形成有可使接触部件9的针部分9a插入的孔和可使基部9b嵌入的槽。
由图2和图5所示，当接触部件9呈插入上述孔和槽的固定状态时，其针部9a由上夹具3上突出。通过交替配置具有不同的基部9b长度的两种接触部件9，可使突出于上夹具3的16个针部9a呈锯齿状地排成两列。如下所述，可用接线柱在实际安装时将这些针部分9a与外部的连接用印刷电路配线板5相接。
接触部件9的可动接触部9d，当接触部件9呈插入固定在上夹具3的孔和槽中的状态时，会由上夹具3凹下而突出。这一状态已由与图2的组装图相反一侧观看用的组装8清楚示出。当夹具3、4处于夹持一体化复合电极2的固定状态时，各接触部件9的可动接触部9d与一体化复合电极2的电连接点7相接触，且由于弯曲部9c的弹性变形，可在接触部产生预定的接触压力。这样，通过光栅状导电带12与一体化复合电极2的微电极11相连接的电连接点7，可以在较小接触电阻(30毫欧以下)的条件下，与接触部件9电连接。
下面说明印刷电路配线板5。该导电用图形配线板5在固定一体化复合电极2和夹具3、4的组合体同时，还承担把从一体化复合电极2的微电极至导电用图形带12、电连接点7，至接触部件9间的电连接通过接线端子引出到外部的任务。而且，它还应模拟使对测定装置的调整等处理变得容易得多。
该印刷电路配线板5由双面印刷的玻璃、环氧树脂基板构成。在如图8所示的内表面上，设置有位于形成在中央部位的图形开口周围的四个位置处的接线端子5a。通过将由上夹具3的表面上四个位置突出的呈两列锯齿状排列的16个针部分9a分别插入相对应的接线端子5a，便可以使一体化复合电极2和夹具3、4的组合体的固定时与印刷电路配线板5形成电连接。
在印刷电路配线板5的两侧边部5b，形成有双面边缘接线端子用的2.54mm宽间矩的电连接点，这些电连接点和中央部分的接线端子5a通过引出导电图形5c相连接。在边缘部分5a的内外两面上分别形成有32个、共计64个电连接点，它们分别与两侧接线端子5a的内侧列相连接的表面侧导电图形与其外侧列相连接的里面侧导电图形相连接。为实现可靠的机械固定，还可用止动销钉将上夹具3固定在印刷电路配线板5上。
采用具有上述构成的一体化细胞放置器1构成的细胞电位测定装置的最佳实施例，已在图9示出。本实施例的测定装置，装备有上述的一体化细胞放置器1，包含有用光学手段观察设置在该一体化细胞放置器1中的细胞的倒立式显微镜21的光学观察组件20，包含有向细胞供给刺激信号的组件和处理由细胞输出的输出信号的组件在内的计算机30，以及用于维持细胞培养气氛的气体的细胞培养组件40。在光学观察组件20中，包含有设置在一体化细胞放置器1上的倒立式显微镜21(欧林巴斯制造的1MT-2-F型或IX70型或其类似产品)以及显微镜用SIT摄象机(浜松霍托尼克斯制造的CZ400-08型或类似产品)22，高精细度显示器23，图象外存储器装置(松下制造的TQ-2600型或FTQ-3100型或类似产品)24。而且，高精细度显示器23还可以兼用作计算机30的显示器。上术括号内示出的仅仅是具体装置的一个实例，但并不仅限于此，以下也如此类推。在计算机30中，装载使用与WINDOWS相对应的专用计算机中的A/D转换板及其测定用软件。A/D转换板包含有图9中的A/D转换器31和D/A转换器32。A/D转换器31是16位64通道的，D/D转换器32是16位8通道的。
测定用软件包括用于设定供给测定信号条件的和所获得的检测信号的记录条件的软件。通过该测定用软件，计算机30不仅是由向细胞供给刺激信号的组件和处理由细胞检测出的信号的组件构成，而且还是光学观察组件(SIT摄象机和图象显示装置)和细胞培养组件的控制中枢。下面参考画面来说明测定用软件的主要规格标准。
对于参数设定显示画面，可通过用键盘或鼠标在画面上描述刺激波形的方式设定复杂的刺激条件。记录条件的设定，可按输入通道数为64、取样速率为10KHZ的方式进行相应于数小时的连续记录。而且，对于供给刺激信号的电极和获得由细胞输出的检测电极的指定，可用鼠标或键盘指示在画面上显示的显微镜象的方式进行指定。细胞培养组件40的温度、PH值等等条件，也可以用键盘设定。
在记录显示画面上，由细胞检测的自发活动电位或感应电位，可实时地用最大为64路的通道显示出来。还可以在细胞显微镜象上重叠显示出已被记录的自发活动电位或称感应电位。在测定感应电位时可显示全部的记录波形。在测定自发活动电位时，可用窗口识别器或波形识别器，仅显示具有峰值信号的、检测列自发活动发生时的记录波形。在显示记录波形的同时，还可以实时显示记录时的测定参数(刺激条件，记录条件，温度，PH值等)、它还可以具有当温度或PH值超出允许范围之这外时能发出警报的功能。
在数据解析显示画面上，可进行FFT解析，相干解析和相关解析等等。所用的波形识别器应具有单个峰值信号分离功能，临时剖面轮廓显示功能，外形显示功能，电流源密度分析功能等。这些解析结果可保存在图象外存储装置中，并可在显微镜上再次显示。
当由上述的计算机输出刺激信号时，该刺激信号将由D/A转换器32及隔离器(BAK ELECTRONICS公司制造的BSI-2型及类似产品)33加在细胞上，即在由一体化细胞放置器1的64个微电极11中选出的两点间加刺激信号。这样，在各微电极11同GND电平(培养液电位)之间将产生感应电位，后者将通过64通道的高灵敏度放大器(日本光电AB-610J或类似产品)34及A/D转换器31输入至计算机30。放大器34的放大倍数为100db，频带范围为0-10KHZ。然而，在测定由刺激信号产生的感应电位时可用低截止滤波器使频带范围为100HZ-10KHZ。
在细胞培养组件40中配置温度调节器41，培养循环组件42，供给空气和二氧化碳混合气体的组件43。实际上，可用MEDICALSYSTEM公司制造的微型细胞培养器PDMI-2或类似产品和温度控制器TC-202或类似产品，以及CO2储气瓶等构成细胞培养组件40。可用佩尔蒂元件将该微型细胞培养器和温度范围控制在0-50℃之间，并使相应的输液速度在3.0ml/min以下，供气速度在1.0l/min以下。也可以采用内装有温度控制器的微型细胞培养器(欧林巴斯公司制造的IMT2-IBSV型)。
以上说明了根据本发明构造的细胞电位测定装置的最佳实施例，但本发细胞电位测定装置并不仅限于上述实施例，下面举例说明各种可能的变型实施例。
在上述实施例中，供给刺激信号的组件既可以由计算机及D/A转换器构成，也可以由通用或专用脉冲信号发生器构成。而且，为了排除人为因素的影响，即为了不使直流成分流过，刺激信号最好是用正负一对脉冲构成的双极性定压脉冲构成。而且，最好将其转换为额定电流脉冲，以便不产生过电流，例如，可用脉冲宽度为100微秒的正脉冲，100微秒的间隔，100微秒的负脉冲构成刺激信号，且最好使正负脉冲的峰值电流在30-200微安的范围内。
虽然通过将细胞培养组件40配置在测定装置上，可进行长时间的连续测定，但也可以在细胞培养器内再设置一个测定装置。当将样品细胞放置在一体化细胞放置器中进行培养且仅需进行短时间的测定时，就不需要将一体化细胞放置器由细胞培养器内取出再放置在测定装置上。对于这种场合，便可以不将细胞培养组件40配置在测定装置上。
下面说明采用上述细胞电位测定装置测定伴随着一体化细胞放置器中实际培养的神经细胞或组织的活动产生的电位变化的一个实例。可用老鼠大脑皮层切片作为神经组织，并按后面描述的培养方法实施例中所示的方法进行培养。
首先说明对采用本装置的一体化细胞放置器测量的电压波形，与采用原有的通用玻璃电极(细胞外电位测定用电极)测定的电压波形进行比较的结果。测定是对经过了14天培养的神经组织作为样品进行的。在构成为一体化细胞放置器的一体化复合电极的相邻两个电极间加刺激信号，测定附近的八个电极上感应出的感应电位随时间变化的波形。为进行上述比较，用三维微控制器将玻璃电极依次移至上述8个电极附近，便可测定到同样的电压波形。
如上所述，由在八个位置用一体化复合电极(一体化细胞放置器)测定的电压波形，和用玻璃电极测定到的波形的比较结果可知，二者波形在任何位置均大体相似。其典型例如图10(A)和(B)所示。图10(A)为用一体化复合电极测定的波形，图10(B)为用玻璃电极测定的波形。比较两波形，可见其频率特性略有差异。用玻璃电极测定时与用PLANAR电极测定时相比，相应于电位快速变化的跟踪特性有若干损失。这一差异被认为是由玻璃电极与PLANAR电极具有不同电容量所引起的。
下面说明调节了在一体化细胞放置器上培养的神经细胞的培养天数和由细胞活动产生的电位分布间关系的实验结果。为了在细胞开始培养使一体化复合电极的各电极与细胞具有较高的粘连性，可在一体化复合电极的表面涂复上胶原胶滞体。即在上述的由铂黑覆盖的各电极表面及其周围的绝缘掩膜表面上形成一层50微米以下的胶原凝胶。然后在胶原凝胶上，即微电极上的位置处放置老鼠的大脑皮质切片(厚度为500微米以下)，并培养之。图11示出了自发电位的测定结果，图12示出了加上刺激信号时的感应电位测定结果。
图11(A)中示出了试样细胞及微电极的显微镜象，用在该图象1-7所示的7个位置的电极自发电位波形分别如图11(B)和(C)所示。图11(B)为培养6日后的波形，图11(C)为培养10日后所测得的波形。显微镜象的比例尺，测定波形的时间和电压的刻度，均已显示在图中。以这一测定结果为例，在培养6日后由电极测定的细胞自发活动变弱的各电极间的同步性几乎看不到，与此相反在培养10天后，由于多个神经细胞同时活动，各电极间的同步性明显提高。图12(A)示出的也是样品细胞和微电极的显微镜象。通过包含上述计算机测定用软件的图象处理技术，可以在画面上给出该显微镜象上的细胞的轮廓和各电极的位置，而且叠加示出的各电极测定的电压波形也示出在图12(B)和(C)中。图12(B)示出的是培养5天后的感应电位的分布，图12(C)示出的是培养10天后的感应电位的分布，在右上处用“+”、“-”号标出的一对电极，是供给刺激信号的电极。在表示各电极位置的小方形记号的上侧附近，示出的是用该电极测定的波形。在这些波形中，左端的较大振幅为与刺激信号直接相对应的人为因素的影响，而其后的电位变化表示的是细胞的实际活动，若以该测定结果为例，培养5天后的细胞活动，仅限于所加刺激信号位置的附近，经培养10天后，则可观察到细胞在较大范围内活动，且其大小(振幅)也比较大。(1)培养基在由DARUBECO改进型伊格尔培养基和哈姆F12型培养基按1∶1混合而成的培养基(GIBCO CO.LT D.430-2500EB)中，添加下述添加物后使用。
葡萄糖(glucose，GIBCO 820-5023IN)2.85mg/l(加上原包含在上述培养基中的这种物质，其6mg/l)腐胺(putrescine，SIGMA CO，LTD，P 5780)100uM黄体酮(progesterone，SIGMA P8783)20nM皮质醇(hydrocortisone，SIGMA H0888)20nM亚硒酸钠(sodium selenite，WAKO Co.，LTD.198-0319)20nM胰岛素(insulin，SIGMA 16634)5mg/l铁传递蛋白(transferrin，SIGMA T1147)100mg/l重碳酸钠2.438mg/l适量加入1N HCl或1N NaOH，以将PH值调整为7.4。
加入上述添加物并经过过滤杀菌后，在4℃保存以备使用。以下将本培养基简称为培养基。
(2)一体化复合电极凹下部分的构成为便于在一体化复合电极上培养神经细胞或细胞组织，应按下述方法，将内径为22mm外径为26mm，高为8mm的聚苯乙烯制圆筒粘接其上。
(イ)在聚苯乙烯制圆筒(内径22mm，外径26mm，高8mm)的下表面上涂复上足够量的一种液态硅类粘接剂(DAUNING 891型或信越化学KE-42RTV型)。
(ロ)在确保一体化复合电极的玻璃基板中心与聚苯乙烯制筒中心相吻合的条件下，将两者连接起来。
(ハ)在埃尘难以进入的环境下放置24小时，以使粘接剂固化。
(二)用70％的乙醇渍浸5分钟后，用在净化箱内风干的方式进行灭菌处理，准备对电极表面处理。
(3)电极表面的处理为提高一体化复合电极表面的细胞粘连性，可按下述方法在电极表面制成胶原凝胶。以下的操作均在无菌条件下进行。
(1)制备下述的A、B、C溶液并冷冻。
A.O.3％体积的稀盐酸胶原(PH3.0，新田明胶CellmatrixType I-A)B.在由Darubeco改进型伊格尔培养基和哈姆F12型培养基按1∶1混合而成的培养基(GIBCO430-2500EB)中，在加入重碳酸钠之前，制作成浓度为通常使用时10倍的液体，并进行过滤杀菌，(C)在100ml的0.05N的氢氧化钠溶液中，溶解2.2g的重碳酸钠，4.77g的HEPES(GIBCO 845-1344IM)并进行过滤杀菌。
(ロ)冷却后，8∶1∶1的比例混合A、B、C液。在混合时，应在A和B良好混合后再加入C，然后进行混合。
(ハ)在预先冷却至4℃左右的一体化复合电极的凹下部分内，分散注入1ml的口)的混合溶液，在其没有遗漏地覆盖住电极表面后，用玻璃制的巴斯德氏吸管尽可能除掉混合溶液。通过这一操作，可在电极表面上形成厚度为50μm以下的混合用液的掩膜。
(二)对构成有混合用液掩膜的一体化复合电极，进行37℃的30分钟加热，使混合用液胶凝化，以形成胶原体底层。
(ホ)在一体化复合电极的凹下部分内加入1ml的杀菌水，大约经过5分钟后将杀菌水除去并洗净。
(ハ)重复两次(ホ)的操作(共作3次)。
(ト)在一体化复合电极的凹下部分内，分散注入1ml的已加入了上述添加物(仅除胰岛素和铁传递蛋白之外)的Darubeco改进型伊格尔培养基和哈姆F12型培养基1∶1的混合培养基(GIBCO 430-2500EB)，放置在温度37℃，相对湿度为97％以上，CO2浓度为5％，空气浓度为95％的CO2细胞培养器内，以备使用。
(4)神经细胞或神经组织的培养。
培养形态大体分为两种类型。即神经细胞的分散培养和神经组织的器官培养。下面分别进行描述。
(4-1)大白鼠大脑皮质视觉视野神经细胞的分散培养法。
以下的操作全部需在带菌条件下进行。
(イ)将经过16-18日妊娠的SD大白鼠的胎儿大脑取出，浸在用冰冰冷却后的班克斯平衡盐液(GIBCO 450-1250EB)中。
(ロ)从冷却班克斯平衡盐液中的大脑上切出视觉皮质，并移至所必需的最小量妥卢培养基(GIBCO 410-1100EB)的液体中。
(ハ)在所需最小量的伊格尔培养基液体中，尽可能细小地切断视觉皮质，使其最大也不大过0.2平方毫米。
(二)将已细小切断了的视觉皮质放入离心分离试管，在用不含有钙和镁的班克斯平衡盐液进行三次清洗后，并弥散在适量的同样液体中。
(ホ)在上述(二)的离心分离用试管中，加入溶解有0.25％的胰朊酶的不含有钙和镁的班克斯平衡盐液，使原总液量加倍。在37℃恒温下缓慢搅拌15分钟，使其进行酶反应。
(ヘ)在上述(1-1)所示的培养基(含有添加物。以下简称为“培养基”)中，加入10％体积的牛胎盘血清，再加入至已经过上述步骤ホ)的离心分离用试管中，并使总液量再加倍。用前端经喷灯喷烧过的小口径玻璃制巴斯德吸管，缓缓地反复进行吸管吸移(最多进行20次)，以便使细胞一个个地分开。
(ト)在9806.65m/sec(即1000g)的条件下进行5分钟的离心分离。在离心分离结束后，倒掉上部清液，使沉淀物悬浊在含5％体积牛胎儿血清的培养基中。
(チ)反复进行两次上述(イ)的操作(共3次)(リ)使最终获得的沉淀物悬浊在含有5％体积的牛儿血清的培养基中，用红白血球计数板检测悬浊液中的细胞浓度。检测后，用同样的培养基将细胞浓度调整2-4×106个/ml。
(ヌ)将经过上述(1-3)处理后保存在CO2细胞培养器内的一体化复合电极取出，除去凹下部分内的培养基(但不包括胰岛素和铁传递蛋白)，分散注入新的含有5％体积的牛胎儿血清的培养基共500μL。然后，静静地加入已由步骤(リ)调整了细胞浓度的细胞悬浊液100μL再静置在CO2细胞培养器内。
(ル)在上述(ヌ)的操作3天之后，将一半量的培养基用新的替换。替换用的培养基为不含有牛胎儿血清的培养基。通过降低牛胎儿血清的浓度可抑制神经细胞以外的其它细胞(例如神经胶原质细胞)的繁殖。
(ヲ)以后每隔1-2天进行与上述同样的培养基的替换。
(4-2)大白鼠大脑皮质切片培养法(イ)将出生2天的SD大白鼠的大脑取出并浸在用冰冷却后的注入有0.25％体积的D-葡萄糖的班克斯平衡盐液中。
(ロ)在用冰冷却后的加入有0.25％体积的D-葡萄糖的HBSS中，在小心地不伤害大脑皮质的条件下，用前端锋利的小镊子除去附着在脑子上的脑膜。
(ハ)用眼科手术用的微型工具，由脑梁的正后头叶侧向前头叶侧切断已除去了脑膜的大脑皮质片侧的脑梁，使其成500μm大小左右。
(二)然后再用眼科手术中用的微型工具，沿与(ハ)的切断面垂直的方向，切断出200-300μm厚的大脑皮质，用作切片。
(ホ)再用眼科手术用微型工具，将切片的大小调整至1×1左右。
(ヘ)将在上述的“(3)电极表面的处理”中已准备好了的一体化复合电极，从CO2细胞培养器中取出，用口径为2mm以上的吸管，以不产生损伤的方式静静地吸取大小已调整过了的大脑皮质切片，将其移入一体化复合电极的培养用凹下部分中。
(ト)用经喷灯烧成光滑的巴德斯管调整大脑皮质切片，使皮质层结构朝上并在电极上，调整时注意不能操作大脑皮质切片。
(チ)将大脑皮质切片调整至一体化复合电极上之后，调整培养基的量，使切片处于其底面与培养基接触，其上面与外部气体接触的状态。
(リ)调整培养量后，将一体化复合电极放入灭菌陪替氏培养皿中，为防止培养基干燥，在陪替氏培养皿中分散注入37℃灭菌水大约5ml，再将其静置在CO2细胞培养器内。
(ヌ)随后每天进行一次培养基的更换，更换时，注意其量与上述步骤(チ)中相同。
以上已经说明，若采用本发明的细胞电位测定装置，不仅可以不损伤放置在一体化细胞放置器中生长着的细胞，而且可以同时在若干个位置测定其活动电位。不仅可以用任意数目的电极测定自发电位，而且还可以用若干个电极同时进行由在任意电极间加刺激信号所获得的感应电位的测定。通过利用计算机等处理手段，可以在用例如光学观察组件所获得的显微镜象来确认样品细胞与电极位置之间关系的同时，确定所要加刺激信号的电极，并可以将由各电极获得的电压波形叠加显示在表示细胞和电极位置的图象上，所以它可以为在电子神经生理学等技术领域中高效率地进行正确的实验作出很大贡献。
通过把维持调整后的细胞的培养气氛的培养组件安装在一体化细胞放置器上，可以使样品细胞在测定装置上一直保持在调整状态下，以便在稳定状态下进行长时间连续测定。
权利要求
1.用于测定细胞电子生理学特性的细胞电位测定装置，其特征在于它装备有，A.一体化细胞放置器，它具有设置在基板上的若干个微电极，设置在这些微电极上的用于放置细胞的细胞放置单元，以及用于向上述微电极供给电信号并由上述微电极导出电信号的电连接组件；B.刺激信号供给组件，它与上述一体化细胞放置器的电连接组件相连接，以便用于向上述细胞供给电刺激信号；C.信号处理组件，它用于处理由上述细胞的电生理活动所产生的输出信号，并与上述一体化细胞放置器的电连接组件相连接。
2.如权利要求1所述的细胞电位测定装置，它还装备有用光学方式观察上述细胞的光学观察组件。
3.如权利要求1所述的细胞电位测定装置，它还装备有用于将设置在上述一体化细胞放置器上的细胞保持在培养气氛中的细胞培养组件。
4.如权利要求3所述的细胞电位测定装置，其细胞培养组件是由使温度保持一定的温度调节组件，使培养液循环的组件，以及供给空气和二氧化碳的混合气体的组件构成。
5.如权利要求1所述的细胞电位测定装置，上述一体化细胞放置器具有配置在玻璃板上呈矩阵状的若干个微电极，这些微电极引出用的导电图形与这些导电集成电路的端部相连接的电连接点以及覆盖在上述导电图形表面上的绝缘掩膜，在包含有上述若干微电极的区域内设置上述细胞放置单元。
6.如权利要求1所述的细胞电位测定装置，是将呈8行8列配置的64个电极作为上述若干个微电极。
7.如权利要求1所述的细胞电位测定装置，其上述微电极的各电极面积在4×102-4×104平方微米之间。
8.如权利要求5所述的细胞电位测定装置，其上述电连接组件包含有具有与上述电连接点相接触的接触组件和可以上下侧夹持固定住上述玻璃板的两个开口夹具。
9.如权利要求5所述的细胞电位测定装置，其上述电连接组件具有印刷电路配线板，它固定在上述夹具上，同时具有通过接线端子与上述夹具的接触组件相连接的外部连接导电图形。
10.如权利要求8所述的细胞电位测定装置，上述电连接点与上述接触组件间的接触电阻，以及上述接触组件与上述接线端子间的接触电阻均在30欧姆以下。
11.如权利要求1所述的细胞电位测定装置，上述光学观察组件装备有光学显微镜、与其相连接的摄象装置及其图象显示装置。
12.如权利要求10所述的细胞电位测定装置，上述光学观察组件还具有图象存储装置。
13.如权利要求1所述的细胞电位测定装置，其上述刺激信号供给组件为脉冲信号发生器。
14.如权利要求1所述的细胞电位测定装置，上述信号处理组件装备有用于放大由上述细胞的电生理活动所产生的输出信号的多通道放大器以及用于实时显示已放大后的信号波形的多通道显示单元。
15.如权利要求1所述的细胞电位测定装置，它还具有计算机，后者用于通过D/A转换器输出上述刺激信号，处理通过A/D转换器输入的由上述细胞的电生理活动所产生的输出信号，并且对上述光学观察组件及上述细胞培养组件进行控制。
全文摘要
本发明提供了一种细胞电位测定装置，它具矩阵状地配置在基板上的多个微电极，设置在其上的用于放置细胞的细胞放置单元，以及具有从微电极引出的导电图形和与外部连接用的电连接点的一体化复合电极构成的一体化细胞放置器(1)，用光学方式观察细胞的光学观察组件(20)，向细胞提供电刺激信号并与细胞放置器连接的刺激信号供给组件(30)，以及处理由细胞电生理活动产生的输出信号并与细胞放置器相连接的信号处理组件。
文档编号G01N33/487GK1131744SQ9510851
公开日1996年9月25日 申请日期1995年6月13日 优先权日1994年6月13日
发明者杉原宏和, 龟井明仁, 小林康, 竹谷诚, 光亦忠泰 申请人:松下电器产业株式会社