专利名称：细胞外电位测量用传感元件、测量器件、装置及测量方法
技术领域：
本发明涉及一种把在细胞等活体试样发生的电化学变化作为指标来简单高速地进行生物试样的电生理学评价的细胞外电位测量用传感元件和细胞外电位测量器件。而且，本发明还涉及细胞外电位测量装置和使用该装置的细胞外电位测量方法。
背景技术：
现有技术中，将细胞电活动作为指标来筛选药品是通过膜片钳(patchcramp)法、使用荧光色素或者发光指示剂的方法进行的。
膜片钳法是使用附在微移液管顶端部分的细胞膜的微小部分(下面称为片)，通过微小电极探针来电记录介由单个通道蛋白质分子之离子输送的方法。膜片钳法是能够实时研究一个蛋白质分子之功能的数目不多的方法之一。
另外，还有通过使用根据特定离子浓度变化而发光的荧光色素或者发光指示剂来监视细胞内离子移动以测量细胞电活动的方法(下面称为荧光测量法)。
但是，膜片钳法在微移液管的制作和操作上必须有特殊的技术。于是，膜片钳法在一个试样的测量上需要很多的时间。由于这些，膜片钳法不适合用于高速筛选大量候补药品化合物。
另外，尽管荧光测量法在高速筛选大量候补药品化合物方面是可能的，但必须有细胞染色工序。而且，荧光测量法在测量时由于色素的影响而使背景浓度增高，由于随着时间过去而脱色，使得测量的S/N比变差。
作为代替这些方法的方法，已有在国际公开第02/055653号公报(下面称为专利文献1)上公开的测量细胞外电位的方法(下面称为细胞外电位测量法)。细胞外电位测量法可以得到与用膜片钳法获得的数据相等的高质量数据。而且，细胞外电位测量法能够如荧光测量法那样简单高速地测量大量试样。
专利文献1公开了一种细胞外电位测量器件(下面称为器件)，其测量细胞外电位或者细胞发生的物理化学变化。器件具有至少一个具有设置在基板上的细胞保持机构的坑井(well)。而且，坑井具有用于检测电信号的传感机构。
图40是表示现有技术中细胞外电位测量器件之结构的模式图。培养液110注入到坑井103内。被检体细胞(下面称为细胞)105通过基板102上设置的细胞保持部113被捕捉或保持。细胞保持部113具有在基板102上形成的凹下部104、开口部106和贯通孔107。贯通孔107通过开口部106被连接到凹下部104。而且，在贯通孔107中配置有作为传感机构的检测电极109。然后，检测电极109经过布线108被连接到信号检测部(未图示)。
测量时，通过吸泵(未图示)等从贯通孔107侧吸引细胞105并使其贴紧保持在凹下部104部分上。同时，培养液111流到贯通孔107一侧并接触检测电极109。这样，由细胞105的活动产生的电信号就不会传到坑井103的培养液110，而通过贯通孔107一侧设置的检测电极109检出。
但是，由于使细胞105和药剂(未图示)发生反应，使用以往的细胞外电位测量器件的测量方法必须将药剂注入到培养液110内。向培养液110内注入药剂使得在细胞105周围的培养液110发生流动。当细胞105周围培养液110的流动变化较大时，与检测电极109接触的培养液111出现起伏波动。培养液111的起伏波动对于检测电极109来说就成为噪声。
当测量细胞外电位时，相对检测电极109的噪声就成为使检测电极109检测信号之S/N变坏的原因。由于培养液111的起伏波动而产生的噪声一般来说是100Hz以下的低频。另一方面，细胞外电位的变化是以DC成分到5kHz左右的周期变化的信号。即，两个信号的频带重叠。
另外，尽管试图用电滤波器等来降低噪声成分，但DC成分附近的低频区域的信号也被切掉了。而且，根据滤波器特性，高于100Hz的区域的信号有时也被切掉了。结果，正确捕捉细胞105产生的细胞外电位信号变得困难了。
发明公开本发明的细胞外电位测量用传感元件具有基板、在基板上设置的坑井、在坑井的壁面上设置的引导部以及在基板的下面设置的检测电极。引导部引导药剂。在坑井的底面设置有凹下部和用于贯通凹下部和基板下面的第一贯通孔。坑井使被检体细胞、培养液和药剂相混合。
图1是实施方式1中的细胞外电位测量器件的部分切除分解斜视图。
图2是图1所示器件中使用的传感元件的部分切除分解斜视图。
图3是图2所示传感元件主要部分的部分切除放大斜视图。
图4是表示图1所示器件之使用方法的剖面图。
图5是图1所示器件的放大剖面图。
图6是图1所示器件的放大剖面图。
图7是图1所示器件的剖面图。
图8是图1所示器件的剖面图。
图9是表示图1所示器件上使用的传感元件的斜视图。
图10是表示图1所示器件上使用的传感元件的斜视图。
图11是表示图1所示器件中的细胞外电位之测量方法的流程图。
图12是表示图1所示器件中的细胞外电位测量方法之测量数据的特性图。
图13是表示图1所示器件之制造方法的剖面图。
图14是表示图1所示器件之制造方法的部分放大剖面图。
图15是表示图1所示器件之制造方法的部分放大剖面图。
图16是表示图1所示器件之制造方法的剖面图。
图17是表示图1所示器件之制造方法的剖面图。
图18是表示图1所示器件之制造方法的剖面图。
图19是表示图1所示器件之制造方法的剖面图。
图20是表示图1所示器件之制造方法的剖面图。
图21是表示图1所示器件之制造方法的剖面图。
图22是实施方式2中的细胞外电位测量器件的部分切除分解斜视图。
图23是图22所示器件的部分切除分解斜视图。
图24是图22所示器件中使用的传感元件的部分切除分解斜视图。
图25是图24所示传感元件主要部分的部分切除放大斜视图。
图26是本发明的细胞外电位测量器件的部分切除斜视图。
图27是本发明的细胞外电位测量器件的部分切除斜视图。
图28是表示图22所示器件之制造方法的部分放大剖面图。
图29是表示图22所示器件之制造方法的部分放大剖面图。
图30是表示图22所示器件之制造方法的部分放大剖面图。
图31是表示图22所示器件之制造方法的部分放大剖面图。
图32是表示图22所示器件之制造方法的部分放大剖面图。
图33是表示图22所示器件之制造方法的部分放大剖面图。
图34是表示图22所示器件之制造方法的部分放大剖面图。
图35是表示图22所示器件之制造方法的剖面图。
图36是实施方式3中的细胞外电位测量器件的部分扩大剖面图。
图37是表示图36所示器件之制造方法的部分放大剖面图。
图38是表示图36所示器件之制造方法的部分放大剖面图。
图39是实施方式3中的细胞外电位测量器件的部分放大剖面图。
图40是现有技术细胞外电位测量器件的模式剖面图。
具体实施例方式
实施方式1图1是实施方式1中的细胞外电位测量器件的部分切除分解斜视图。图1是用剖面图来表示容器的一部分，以可见容器内部。图2是细胞外电位测量用传感元件(下面称为传感元件)的部分切除斜视图。另外，图3是图2所示的传感元件主要部分的部分切除放大斜视图。
细胞外电位测量器件(下面称为器件)51是细胞外电位测量用传感元件1连接在容器2上的结构。传感元件1是由硅和二氧化硅的层叠体构成。另外，容器2由作为电绝缘体的树脂构成，容器2上设置有用于测量容器2中电位的参考电极7。
在传感元件1内设置有具有从传感元件1上面开口的坑井9。在坑井9的底面设置有第一微小贯通孔(下面称为贯通孔)3和凹下部4。具有小于凹下部4的孔径的贯通孔3贯通凹下部4底面和传感元件1下面。另外，如图3所示，在贯通孔3下部的传感元件1下面设置有测量用检测电极8。
在容器2的底部设置有第二贯通孔(下面称为贯通孔)5。贯通孔5的尺寸大于坑井9开口的尺寸。而且，坑井9的壁10的形状变成研钵状。坑井9承担了储藏培养液和药剂的任务。
另外，在容器2的侧面设置有第三贯通孔(下面称为贯通孔)6。管11被插入到贯通孔6中。管11的顶端通过以贯通孔6作为引导被更精确地定位在形成贯通孔3和凹下部4的位置上。
图5和图6是表示用氧化膜46覆盖凹下部4和贯通孔3的情况。氧化膜46在必要时可根据测量对象细胞的种类、大小等而形成。氧化膜46是多种多样的，可以类似热氧化膜厚度为10000埃或其以上，也可以类似自然氧化膜为500埃或其以下。氧化膜46的厚度不是构成本发明的必要条件。
下面，说明器件51的使用方法。
图4是表示器件51使用方法的剖面图。图5和图6是贯通孔3和凹下部4的部分放大剖面图。
当培养液22和被检体细胞(下面称为细胞)21被注入到容器2时，细胞21在培养液22中浮游。在培养液22不只充满容器2内部，还充满凹下部4、贯通孔3之后，在检测电极8一侧溢出。
如图5和图6所示，在培养液22中浮游的细胞21根据容器2内的压力，被引入到凹下部4。当对细胞21的引入压力不足时，通过使用吸泵(未图示)等从检测电极8一侧吸引培养液22。于是，浮游在培养液22中的细胞21被确实可靠地吸引到凹下部4。设计贯通孔3的尺寸小于细胞21。因此，细胞21被保持在凹下部4的内部。
另一方面，为了确实可靠地将药剂(未图示)投放到细胞21的周围，用于投放药剂的管11的顶端应该尽可能设置在距离保持有细胞21的凹下部4较近的位置。通常，管11使用直径为1mm或其以下的极细的管子。因此，如图7和图8所示，当从充满了培养液22的容器2的上部放入管11时，管11因受到培养液22表面张力的作用而变弯。所以，难以将管11的顶端高精度地定位到规定位置。
因此，贯通孔6以从形成贯通孔3和凹下部4的位置成为放射状的方式而被设置在容器2的侧面上。然后，管11插入到贯通孔6中。因此，管11的顶端位置可以被高精度地设定在贯通孔3和凹下部4的极近处。
因此，即使容器2中充满培养液22，管11的顶端也不会受到培养液22的表面张力的作用，并能容易地定位到规定位置。即，贯通孔6的壁面完成了引导管11的引导任务。由此，常常可以使药剂的投放稳定进行。
另外，通过将坑井9的壁10做成研钵形状，药剂容易浸透到坑井9的内部。因此，即使当从管11的药剂投药压力低时，也能够完成向被保持在凹下部4之细胞21附近的可靠药剂投药。由此，细胞21不会被随意地施加压力，可以防止细胞21被施加压力而引起的振动。壁10由于被做成研钵形状，因此是作为将药剂引导到坑井9内的引导部而发挥作用。
其中，贯通孔5比坑井9的开口大，因此不会遮蔽坑井9的研钵形形状。由此，药剂容易浸透到坑井9的底部。
而且，管11的材料优选树脂、玻璃或者二氧化硅的任何一种。这些材料是电绝缘体，即使插入到容器2中也不会随意地扰乱培养液22的电位。
另外，如图9所示，坑井9A的壁10A的形状也可以是螺旋形状。通过使壁10A成为螺旋形状，即使药剂的投药压力设定得较低且药剂的流入速度也较低，所投放的药剂也能够均匀地混合到坑井9A内的培养液22中。具有螺旋形状壁10A的传感元件1A可以进行误差少的高精度测量，所以是有效果的。
而且，如图10所示，坑井9B的壁10B的形状也能够做成朝向中心的放射状。通过使壁10B成为放射形状，即使药剂的投药压力设定得较低且药剂的流入速度也较低，所投放的药剂也能够均匀地混合到坑井9B内的培养液22中。具有放射形状壁10B的传感元件1B可以获得与螺旋形状时相同的效果。螺旋形状或者放射形状的壁10A，10B与研钵形状的壁10相同，都作为将药剂引导至坑井9A，9B内的引导部而发挥作用。
其中，凹下部4的尺寸依赖于作为测量对象的细胞21而变化，可以为将细胞21保持在凹下部4内的尺寸。典型地，凹下部4的直径为10-500微米，深度为1-500微米。优选凹下部4的直径为10-100微米，深度为2-100微米。进一步优选凹下部4的直径为20微米，深度为10微米或者20微米。
另外，与凹下部4相同，贯通孔3的尺寸也依赖于测量对象的细胞21而变化，可以为将细胞21保持在凹下部4内的尺寸。典型地，贯通孔3的直径为5-100微米，深度为10纳米-100微米。优选贯通孔3的直径为5微米，深度为1.5微米。
接着，说明利用了器件51的细胞外电位的测量方法。
首先，通过管11将药剂投放到容器2内的培养液22中。药剂浸透到培养液22内部，然后浸透到保持在凹下部4中的细胞21的周围。
如图6所示，在细胞21通过药剂而被活化之后，细胞21通过细胞膜内的离子通道(未图示)摄取或反过来释放Na+，K+，Ca+等离子的离子交换频率增加。离子交换是在药剂作用下反应的细胞所发生的电化学变化。
离子交换频率的增加使细胞21周围或者贯通孔3内部的培养液22中的离子浓度发生变化，进而引起电位变化。另一方面，贯通孔3内部的培养液22的电阻通常维持在5兆欧以上以与容器2内部的培养液22分开。因此，能够将贯通孔3内部的离子浓度或者电位变化作为电信号而从检测电极8中取出。
这里，细胞21与培养液22之间的离子交换频率根据细胞21的种类而多种多样。但是，一般地，离子交换现象不是以特定周期而同步进行的，而是在各离子通道上随机进行的。即，检测的电信号不是只在特定的频率下观测的，而是宽幅检测从DC到5kHz左右的频率信号。
图11是表示细胞外电位测量方法的流程图。首先，用作为传感部的检测电极8所检测的电压或者电流的电信号62由放大器63放大。被放大的电信号64通过高速傅立叶变换器(下面称为FFT)65在规定时间内积累以进行频域变换。接着，频域上的信号强度66在每个规定时间上由计算机67描绘。这样，用检测电极8测量的电信号62在频率变换之后被计算机所描绘。
从外部混入的噪声具有周期性的频率成分。因此，通过分析频域上的信号强度66，细胞21产生的电信号与噪声可在视觉上被区分开。所以，即使在产生有来自外部的电源噪声的情况下，也能够容易地将细胞21产生的电信号与噪声区分开。本发明的细胞外电位测量方法能够正确地捕捉到药剂所引起的细胞21的反应变化。
图12是通过细胞外电位测量方法获得的测量数据的特性图。在图12中，横坐标以秒为单位表示测量时间。纵坐标是频率，其以浓度绘出在横坐标的测量时间中的频率的信号强度(称为等高线(contour)图)。在图12中，在信号72和信号73可以看到横线。即，信号72和信号73具有周期性频率成分，因此是从外部电源等混入的噪声。信号71和信号74不具有周期性频率成分，其是通过改变细胞21附近的离子浓度而被观测到的电信号。
接着，说明本实施方式1的细胞外电位测量器件51的制造方法。图13和图16-图20是表示细胞外电位测量器件51之制造方法的传感元件1的剖面图。图14和图15是表示细胞外电位测量器件51之制造方法的传感元件1的部分放大剖面图。图21是表示细胞外电位测量器件51制造方法的剖面图。
如图13所示，基板40是将基底41、中间层42和薄板43层叠而成的。然后，基底41和薄板43由硅构成，中间层42由二氧化硅构成。在基板40的薄板43的一面上形成有规定图案的抗蚀剂掩膜44被形成。其中，基板40的原材料一般被称为SOI基板，在制作半导体器件时经常使用。因此获得比较容易，所以省略对基板40制造方法的说明。
首先，如图14所示，通过干式蚀刻形成贯通孔3，并达到薄板43的规定深度。形成贯通孔3的方法最好为采用干式蚀刻的方法。干式蚀刻使用了促进蚀刻的气体(下面称为促进气体)(未图示)和抑制蚀刻的气体(下面称为抑制气体)(未图示)。促进气体是XeF2，CF4，SF6等。另外，抑制气体是CHF3，C4F8等。混合促进气体和抑制气体来进行蚀刻，由蚀刻所形成的孔的壁面被作为CF2聚合物的保护膜所覆盖。当孔的壁面被保护膜覆盖时，抑制向壁面的蚀刻。结果，通过干式蚀刻的贯通孔3的形成是在只在抗蚀剂掩膜44的下方具有各向异性的情况下而进行的。
这里，再稍微详细地说明通过只在下方具有各向异性来进行蚀刻的结构。
首先，在蚀刻工序中，通过促进气体而仅稍微进行蚀刻。此后，在保护膜形成工序中，通过抑制气体而仅稍微形成保护膜。通过蚀刻工序和保护膜形成工序的相互重复进行，在大致垂直方向上进行由蚀刻实现的开孔加工和孔壁面的保护膜形成。
在蚀刻工序中，在通过外部线圈的感应耦合所生成的等离子体中，对基板40施加高频电压。于是，在基板40上产生负偏压，等离子体中作为正离子的SF5+或者CF3+朝着基板40碰撞。由此，干式蚀刻向垂直下方的方向进行。于是形成了贯通孔3。
另一方面，在保护膜形成工序中，不对基板40施加高频电压。于是，在基板40上完全不产生偏压，所以等离子体中的正离子没有受到偏转，干式蚀刻被抑制。然后，成为保护膜材料的CF+在蚀刻工序中出现的新面上发挥作用。其结果，相对于由干式蚀刻形成的贯通孔3的壁面而形成均匀的保护膜75。实验中，通过使用了作为促进气体的SF6和作为抑制气体的C4F8的干式蚀刻，确认了贯通孔3和保护膜75的形成。
如上所述，当通过使用了促进气体和抑制气体的干式蚀刻来进行贯通孔3的形成时，贯通孔3是向着抗蚀剂掩膜44下方的深度方向进行而形成的。然后，通过使用抑制气体，在贯通孔3的壁面上形成保护膜75。
接着，如图15所示，例如，只使用XeF2等促进气体来进行干式蚀刻。促进气体不蚀刻形成在贯通孔3的壁面上的保护膜75。然后，只在贯通孔3底面的硅上面进行蚀刻。而且，由于促进气体不蚀刻二氧化硅，也就不蚀刻中间层42。其结果是形成了比贯通孔3大的凹下部4。
接着，如图16所示，进行在基底41面上形成抗蚀剂掩膜45的蚀刻。于是，如图17所示，形成了坑井9。关于坑井9形成时的蚀刻方法，例如是只使用XeF2或者SF6等促进气体的干式蚀刻。由此，坑井9侧面的壁10成为研钵形状。
另外，为了使坑井9形成螺旋形状或者放射形状，可以适宜地进行使用了适当的蚀刻掩膜的蚀刻。在这种情况下，蚀刻所使用的气体不只使用促进气体，也使用了抑制气体。
接着，如图18所示，用湿式蚀刻或者干式蚀刻等一般方法对中间层42进行蚀刻。
接着，除去抗蚀剂掩膜45。而且，如图19所示，通过一般的热氧化工序在硅表面上形成热氧化膜46。其中，热氧化工序被用于希望尽量增加硅表面电阻的场合。当硅的表面不需要高表面电阻时，只需在硅表面上自然地形成自然氧化膜就可以了。
接着，如图20所示，通过使用了例如Au、Al、Ti、Cr等金属的溅射或者真空蒸镀等通常的薄膜形成机构，在薄板43的面上形成检测电极8。
如上所述，通过在基板40上实施各种加工而制成传感元件1。通过将由硅和二氧化硅的层叠体所构成的SOI基板用作基板40的材料，能够极其简便地进行高精度的加工。由此有效地制造传感元件1。
最后，如图21所示，通过使用粘结剂50等使传感元件1粘结到容器2上。而且，由于容器2是用树脂成型加工等一般方法制成的，因此省略对其的说明。另外，容器2的材质优选电绝缘材料，以使容器2内的培养液22的电位不会随意地变化，并且不对测量造成不良影响。
而且，在测量时插入参考电极7和管11。
其中，在使用作为硅和二氧化硅的层叠体的基板40的情况下对传感元件1进行说明。但是，中间层42的材质不局限于二氧化硅。与硅制基底41和薄板43相比，中间层42很难被蚀刻而能够使用电绝缘性高的材料。中间层42的材质也能够使用例如包含二氧化硅的玻璃材料。
实施方式2使用图22到图27来说明实施方式2。对于和实施方式1相同构成的部分，给出相同的符号来说明。图22是实施方式2中的细胞外电位测量器件的部分切除分解斜视图。图23是图22中容器的部分切除分解斜视图。图24是传感元件的部分切除斜视图。图25是图24所示传感元件的部分切除放大斜视图。
在图22中，细胞外电位测量器件(下面称为器件)81是由传感元件12连接到容器13的下部而构成。容器13由电绝缘树脂构成，在容器13内部安装用于测量容器13内部电位的参考电极7。
另外，传感元件12由硅和二氧化硅的层叠体构成。然后，在传感元件12的下部设有开口部20。检测电极19被设置于通过开口部20在传感元件12下部形成的传感元件12的下面。凹下部4设置在传感元件12的上部。而且，设置有贯通凹下部4的底面和设置了检测电极19的传感元件12的下面的第一微小贯通孔(下面称为贯通孔)3。
第二贯通孔(下面称为贯通孔)14形成在容器13的底部。贯通孔14的壁15的形状是研钵形状。然后，由连接在容器13下部的传感元件12的上面16、贯通孔14和壁15形成了坑井17。本实施方式2与实施方式1之间的差别在于坑井17的结构不同。
而且，第三贯通孔6设置在容器13的侧面上。假定传感元件12连接到容器13下部，贯通孔6是以从贯通孔3和凹下部4附近的规定位置呈放射形状贯通的方式而形成的。
这里，器件81的使用方法和利用器件81的细胞外电位测量方法几乎与实施方式1的相同。
通过使壁15成为研钵形状，当测量细胞外电位时，即使药剂投放的流入速度放慢，药剂也能可靠地浸透到凹下部4所保持的被检体细胞21的周围。然后，与实施方式1相同，在细胞21周围的培养液22不会发生流动变化。因此，进行稳定测量是可能的。而且，壁15成为研钵形状，并作为把药剂引导至坑井17内的引导部而发挥作用。
其中，如图26所示，当形成向着容器13A底部贯通孔14A中心的螺旋形状的壁23A时，即使药剂的流入速度进一步降低，也能够使所投放药剂均匀地混合在培养液22中。因此，壁23A可以进行误差少的高精度测量，所以是有效果的。
另外，如图27所示，当壁23B的形状做成向着容器13B底部贯通孔14B的中心呈放射状时，同样也能进行高精度测量，所以也是有效果的。螺旋形状的壁23A或者放射形状的壁23B与研钵形状的壁15相同，都是作为将药剂引导到坑井17内的引导部而发挥作用的。
另外，开口部20不一定是必要的。在本实施例中，为了在用于获得传感元件12之机械强度的传感元件12厚度和贯通孔3深度之间得到平衡而设置了开口部20。因此，如果即使传感元件12较薄也能得到充分的强度，则开口部20不一定是必要的。
接着，说明本实施方式2细胞外电位测量器件81的制造方法。图28-图34是表示细胞外电位测量器件81制造方法的传感元件12的剖面图。图35是表示细胞外电位测量器件81制造方法的剖面图。
如图28所示，基板25由基底26、中间层27和薄板28构成。基底26和薄板28的材质都是硅，中间层27的材质是二氧化硅。抗蚀剂掩膜29形成在基板25的基底26的面上。其中，基板25被称为SOI基板，在制作半导体器件时被经常使用。由于SOI基板容易获得，所以省略对SOI基板的制造方法的说明。
接着，如图29所示，通过使用干式蚀刻、湿式蚀刻等常规的蚀刻方法来蚀刻基底26以形成开口部20。
接着，如图30所示，在基板25的薄板28面上以规定图案形成抗蚀剂掩膜30。
接着，如图31所示，通过干式蚀刻，从基板25的薄板28面开始进行蚀刻。蚀刻所使用的蚀刻气体只是促进气体。促进气体是例如SF6、CF4或者XeF2等。使用促进气体的硅的蚀刻不只对深度方向上的蚀刻有促进作用，对宽度方向上的蚀刻也有促进作用。用使用XeF2的蚀刻来确认实验效果。然后，如图31所示，蚀刻形状成为以抗蚀剂掩膜30的开口部为中心的半球形，并形成凹下部4。另外，由于抗蚀剂掩膜30几乎不被XeF2蚀刻，因此保持了最初的形状。
接着，如图32所示，再次从薄板28面开始进行干式蚀刻。蚀刻气体使用促进气体和抑制气体的混合气体。由此，由于蚀刻是只在垂直下方具有各向异性而进行的，于是从凹下部4的下部连接并形成了贯通孔3。
接着，如图33所示，通过干式蚀刻、湿式蚀刻等通常的蚀刻方法，从基底26面开始蚀刻由二氧化硅构成的中间层27。而且还除去了抗蚀剂掩膜30。
接着，如图34所示，通过通常的薄膜形成技术，从基板25的基底26面开始形成Au作为主体的检测电极19。通过经过上述制造工序，得到了传感元件12。而且，如果需要，还可以在形成检测电极19的工序之前进行热氧化处理，形成覆盖硅表面的热氧化膜46。
接着，如图35所示，以薄板28的面作为上面，用粘结剂50等将传感元件12粘贴到另外制作的树脂制容器13的底面。其中，容器13由模压成型、光成型、切削加工等常规方法制造。如果使用这些方法，容器13底面的贯通孔14和容器13侧面的贯通孔6可以形成为规定形状。由于贯通孔6和贯通孔4的形成不是特别困难，说明省略。
由此，制作了本实施方式2所示的细胞外电位测量器件81。
另外，在使用作为硅和二氧化硅的层叠体的基板25的情况下对传感元件1进行说明。但是，中间层27的材质不局限于二氧化硅。与硅制基底26和薄板28相比，中间层27难以被蚀刻而能够使用电绝缘性高的材料。中间层27的材质也能够使用例如包含二氧化硅的玻璃材料。
实施方式3使用图36到图38说明实施方式3。其中，对于与实施方式1相同结构的部分，给出相同的符号来说明。
图36是表示本实施方式3中的细胞外电位测量器件的结构的剖面图。
本实施方式3中公开的内容也是在实施方式1或者2所示的细胞外电位测量器件中能够适用的内容。因此可获得同样的效果。
如图36和图38所示，本实施方式3与实施方式1的不同点是在传感元件38上所形成的检测电极8的一部分被绝缘层31覆盖。因此，只在贯通孔3的开口部37附近露出检测电极8。而且，由玻璃构成的绝缘基板39是介由与检测电极8之间的规定空隙而覆盖该检测电极8。
那么，检测细胞外电位的步骤与实施方式1相同。因此，说明省略。在这里，说明将绝缘层31设置在检测电极8的表面上的效果和设置绝缘基板39的效果。
如前面在实施方式1用图4和图5所示的那样，在测量时，培养液22也流出到检测电极8一侧。于是，所流出的培养液22与检测电极8的露出面接触。
另一方面，由于细胞21的离子交换而发生离子浓度变化或者电位变化的区域被限制在细胞21的最近旁。但是，检测电极8不只检测贯通孔3附近培养液22的电位变化。例如，假设在远离贯通孔3的区域(例如图4的圆所包围的区域C)中产生了由和细胞21活动无关的噪声导致的电位变化。于是，检测电极8也检测出这些噪声所造成的电位变化。然后，检测电极8检测的电信号就成为将细胞21的离子交换导致的电位变化和噪声导致的电位变化进行平均的电位变化。作为结果，正确检测出因细胞21的离子交换导致的电位变化就困难了。
因此，如图36所示，检测电极8做成用绝缘层31覆盖检测电极8的一部分并且只露出在贯通孔3的开口部37最近旁的结构。通过这，不会检测出因噪声引起的电位变化(例如在图36的圆所包区域D部发生的变化)。因此，不受来自外部的外扰的影响而能够进行稳定的测量。
检测电极8的露出面积越小，噪声造成的不良影响就越小，就能够进行稳定的测量。而且，为了稳定测量，优选通过绝缘层31覆盖的检测电极8的面积比检测电极8的露出面积大。
另外，绝缘基板39抑制检测电极8面上培养液22的起伏波动而降低因培养液22的起伏波动引起的噪声。即，在图4所示的器件51中，检测电极8面上的培养液22露出到大气中。测量时，在发生外部振动或者大气压力变动的情况下，有时在培养液22的表面会产生起伏波动的情况。当在培养液22的表面上出现起伏波动时，在培养液22中就发生流动。于是，在贯通孔3附近的培养液22上也发生流动，这成为噪声的原因。因此，检测电极8就不能够正确地测量因细胞21的离子交换所发生的离子浓度或者电位的变化。
而且，有时贯通孔3附近的压力发生变化，用于保持细胞21的压力也发生变化。当细胞21受到变化压力时，用于隔开贯通孔3和容器2的电绝缘电阻发生变化。同时，细胞21因外部压力刺激，其电活动状态改变。由于绝缘电阻的变化或者细胞21电活动状态的变化，检测电极8检测的电信号就变化。因此不能够正确地测量因细胞21与药剂反应而发生的离子交换所引起的电位变化。
因此，如图36所示，绝缘基板39通过一定空隙与检测电极8的面连接。在检测电极8一侧流出的培养液22由于被封闭在传感元件38和绝缘基板39之间而不与大气直接接触。由此，受到来自外部的力的情况是极少的。然后，在测量中，即使产生外部振动或者大气压力变动，培养液22的表面也不会起伏波动。
结果，可稳定检测细胞外电位的器件91得到实现。而且，用于封闭培养液22的绝缘基板39优选为电绝缘体，以便培养液22的电位不会随意地不稳定。
下面，说明用于制造实施方式3中器件91的方法。在实施方式3中，由于能够使用前面在实施方式1中说明的制造方法的基板40，省略在实施方式1中说明的工序(图13-图20)。
首先，准备在图20中所示的形成检测电极8的基板40。然后，如图36所示，通过电绝缘材料的溅射、真空蒸镀、旋涂等方法使绝缘层31形成在基板40的形成了检测电极8的面上。电绝缘材料是聚酰亚胺、氟树脂，二氧化硅等。
接着，如图38所示，绝缘层31不需要的部分通过使用了抗蚀剂掩膜的蚀刻等去掉，从而形成具有规定图案的绝缘层31。由此获得只在贯通孔3开口部37最近旁露出检测电极8的传感元件38。
接着，通过使用粘结剂50等，使检测电极8的面向下，把传感元件38粘结到容器2的底面。然后，如图36所示，将绝缘基板39粘结到传感元件38的检测电极8的面上，使得与传感元件38之间具有规定的间隙。为了正确的测量，绝缘基板39的粘结优选使用绝缘性的树脂粘结剂(未图示)。
其中，上述本实施方式3也可适用于根据上述实施方式2的器件81。图39是表示将实施方式3适用于根据实施方式2的器件81的细胞外电位测量器件的部分放大剖面图。
如图39所示，与实施方式2的不同点是在传感元件58上所形成的检测电极19的一部分被绝缘层31覆盖。因此，只露出在贯通孔3开口部37附近的检测电极19。而且，由玻璃构成的绝缘基板39介由和检测电极19的规定空隙而覆盖该检测电极8。因此，可以获得与上述相同的运行和效果。
另外，用于制造细胞外电位测量器件92的方法能够使用与用于制造上述器件91之方法相同的方法。
权利要求
1.一种细胞外电位测量用传感元件，其特征在于，包括基板，在所述基板内设置的、具有底面和壁面、用于将被检体细胞、培养液和药剂混合的坑井，在所述壁面上设置的用于引导所述药剂的引导部，以及在所述基板的下面设置的检测电极；且在所述底面上设置有凹下部和用于贯通所述凹下部和所述基板的下面的第一贯通孔。
2.根据权利要求1所述的细胞外电位测量用传感元件，其特征在于，所述引导部是研钵形状、螺旋形状和放射形状中之一。
3.根据权利要求1所述的细胞外电位测量用传感元件，其特征在于，还包括覆盖所述检测电极一部分的绝缘层。
4.根据权利要求3所述的细胞外电位测量用传感元件，其特征在于，所述检测电极由所述绝缘层覆盖的覆盖面积比所述检测电极的露出面积大。
5.根据权利要求1所述的细胞外电位测量用传感元件，其特征在于，所述基板是硅和在二氧化硅与包含二氧化硅的玻璃材料之中任何一种的层叠体。
6.一种细胞外电位测量器件，其特征在于，包括传感元件，其具有基板，在所述基板内设置的、具有底面和壁面、用于将被检体细胞、培养液和药剂混合的坑井，在所述壁面上设置的用于引导所述药剂的引导部，在所述基板的下面设置的检测电极，并且在所述底面上设置有凹下部和用于贯通所述凹下部和所述基板的下面的第一贯通孔；和容器，其由绝缘体构成，与所述传感元件的上部连接，并且在底部设置了比所述坑井更大的第二贯通孔。
7.根据权利要求6所述的细胞外电位测量器件，其特征在于，所述引导部是研钵形状、螺旋形状和放射形状中之一。
8.根据权利要求6所述的细胞外电位测量器件，其特征在于，所述容器设置了从所述凹下部附近的规定位置以放射形状贯通所述容器的第三贯通孔，还包括插入到所述第三贯通孔、用于将培养液或者药剂之任何一个投放到所述容器内的管。
9.根据权利要求8所述的细胞外电位测量器件，其特征在于，所述管为树脂、玻璃和二氧化硅之中的一种。
10.根据权利要求6所述的细胞外电位测量器件，其特征在于，还包括覆盖所述检测电极的一部分的绝缘层。
11.根据权利要求10所述的细胞外电位测量器件，其特征在于，所述检测电极由所述绝缘层覆盖的覆盖面积比所述检测电极的露出面积大。
12.根据权利要求6所述的细胞外电位测量器件，其特征在于，还包括介由空隙而和所述检测电极对向设置的绝缘体基板。
13.根据权利要求6所述的细胞外电位测量器件，其特征在于，所述基板是硅和在二氧化硅与包含二氧化硅的玻璃材料之中任何一种的层叠体。
14.一种细胞外电位测量器件，其特征在于，包括传感元件，其包括具有上面和下面的基板、在所述下面设置的检测电极，并且在所述基板上设置了凹下部和贯通所述凹下部和所述下面的第一贯通孔；容器，其由绝缘体构成，与所述传感元件的上部连接，并且在底部设置了第二贯通孔；引导部，其设置在所述第二贯通孔的壁面上，用于引导药剂；坑井，其由所述上面和所述引导部形成，并用于将所述药剂、被检体细胞和培养液进行混合。
15.根据权利要求14所述的细胞外电位测量器件，其特征在于，所述引导部是研钵形状、螺旋形状和放射形状中之一。
16.根据权利要求14所述的细胞外电位测量器件，其特征在于，所述容器设置了从所述凹下部附近的规定位置以放射形状贯通所述容器的第三贯通孔，还包括插入到所述第三贯通孔、用于将培养液或者药剂之任何一种投放到所述容器内的管。
17.根据权利要求16所述的细胞外电位测量器件，其特征在于，所述管为树脂、玻璃和二氧化硅之中的一种。
18.根据权利要求14所述的细胞外电位测量器件，其特征在于，还包括覆盖所述检测电极的一部分的绝缘层。
19.根据权利要求18所述的细胞外电位测量器件，其特征在于，所述检测电极由所述绝缘层覆盖的覆盖面积比所述检测电极的露出面积大。
20.根据权利要求14所述的细胞外电位测量器件，其特征在于，还包括介由空隙而和所述检测电极对向设置的绝缘体基板。
21.根据权利要求14所述的细胞外电位测量器件，其特征在于，所述基板是硅和在二氧化硅与包含二氧化硅的玻璃材料之中任何一种的层叠体。
22.一种细胞外电位测量装置，其特征在于，包括传感元件，其具有基板，在所述基板内设置的、具有底面和壁面、用于将被检体细胞、培养液和药剂混合的坑井，在所述壁面上设置的用于引导所述药剂的引导部，在所述基板的下面设置的检测电极，并且在所述底面上设置了凹下部和用于贯通所述凹下部和所述基板下面的第一贯通孔；容器，其由绝缘体构成，与所述传感元件的上部连接，并且在底部设置了比所述坑井更大的第二贯通孔；放大器，其用于放大由所述检测电极检测的电信号；频率变换器，其用于取得并频率变换由所述放大器放大的电信号；和计算机，其用于在每个规定的时间上描绘从所述频率变换器输出的被频率变换的信号。
23.一种细胞外电位测量装置，其特征在于，包括传感元件，其包括具有上面和下面的基板、在所述下面设置的检测电极，并且在所述基板上设置了凹下部和贯通所述凹下部和所述下面的第一贯通孔；容器，其由绝缘体构成，与所述传感元件的上部连接，并且在底部设置了第二贯通孔；引导部，其设置在所述第二贯通孔的壁面上，用于引导药剂；坑井，其由所述上面和所述引导部形成，并用于将所述药剂、被检体细胞和培养液进行混合；放大器，其用于放大由所述检测电极检测的电信号；频率变换器，其用于取得并频率变换由所述放大器放大的电信号；和计算机，其用于在每个规定的时间上描绘从所述频率变换器输出的被频率变换的信号。
24.一种细胞外电位测量方法，其特征在于，包括将被检体细胞产生的电位变化检测作为电信号的检测步骤；放大由所述检测步骤检测的电信号的放大步骤；频率变换由所述放大步骤放大的电信号的频率变换步骤；在每个规定时间上描绘由所述频率变换步骤进行频率变换的信号的描绘步骤。
全文摘要
本发明提供一种细胞外电位测量用传感元件，该传感元件具有在基板上设置的坑井、在坑井底面上设置的凹下部、在基板的底面上设置的检测电极。然后，凹下部通过微小贯通孔贯通到基板的底面。药剂引导部设置在坑井的壁面上，可在坑井内对药剂、被检体细胞和培养液进行混合。通过这个结构，能够正确测量被检体细胞所发生的变化。
文档编号C12M1/34GK1619302SQ20041009521
公开日2005年5月25日 申请日期2004年11月22日 优先权日2003年11月21日
发明者中谷将也, 尾崎亘彦, 冈弘章 申请人:松下电器产业株式会社