双向侧流测试片及方法

专利名称：双向侧流测试片及方法
技术领域：
本发明涉及侧流测试片以及该侧流测试片的操作方法。
对流体样品，尤其是体液样品中的细胞和分析物进行定量分析，通常会为医生和病人提供关键的诊断和治疗信息。例如，利用了抗原-抗体反应高特异性的免疫测试方法，就提供了一种测量分析物的方法(Kennedy，D.M.和S.J.Challacombe(编)，酶联免疫吸附测定和其他固相免疫测定理论和实践(ELISAand Other Solid Phase ImmunoassaysTheoretical and Practical Aspects)，John Wileyand Sons，Chichester(1988)。该文献与本文提及的其他文献都被引用作为参考，就如同它们被完全复制那样。这些分析方法也可用于其他应用方面，例如兽医、食品测试或农业应用方面。
可提供样品中分析物的定量测量值的免疫测定方法，早已使用只有在实验室环境下才有的昂贵分析仪而且所用的程序复杂且步骤多。
免疫色谱分析，例如在下列文献中所描述的免疫色谱分析是较简单的，但是不能提供分析物的定量测量值英国2,204,398A；美国专利No.5,096,837、5,238,652和5,266,497；Birnbaum，S.等人，分析生物化学(Analytical Biochem.)，206168-171(1992)；Roberts，M.A.和R.A.Durst，分析化学(Analytical Chem.)67482-491(1995)；和Klimov，A.D.等人，临床化学(ClinicalChem.)411360(1995)。相反，这些免疫色谱分析检测是否存在高于界定的测试截止水平(cutofflevel)的分析物。无法进行定量测定限制了这些分析方法的用途。
已经开发了各种一次性的诊断测试装置。这些装置的例子包括(但并不限于)Cathy等人的美国专利No.5,660,993；国际出版号WO92/12428；Eisinger等人的美国专利No.4,943,522；Campbell等人的美国专利No.4,703,017；Campbell等人的美国专利No.4,743,560；和Brooks的美国专利No.5,753,517。
提供了一种测试片，该测试片适于接受样品并检测其中的分析物。根据一个实例，测试片包括可加入样品的加样区；位于加样区近端的吸收区；一个或多个位于加样区远端的测试区，其中至少一个测试区包含固定化的第一分析物结合剂，该结合剂能够结合于待检测的分析物；和位于一个或多个测试区远端的末端样品流动区，吸收区的位置与加样区相对而且吸收区相对测试片的其他区域而言具有吸收能力，从而使得加至加样区的样品远端扩散前沿从加样区扩散至末端样品流动区中的远端扩散点，然后逆转方向并扩散至相对于一个或多个测试区的近端。
在另一实例中，提供了一种测试片，该测试片包括可加入样品的加样区；位于加样区近端的吸收区；一个或多个位于加样区远端的测试区，其中至少一个测试区包含固定化的第一分析物结合剂，该结合剂能够结合于待检测的分析物；位于一个或多个测试区远端的末端样品流动区，吸收区的位置与加样区相对而且吸收区相对测试片的其他区域而言具有吸收能力，从而使得按预定体积范围加至加样区的样品远端扩散前沿，从加样区扩散至末端样品流动区中的远端扩散点，然后扩散至相对于一个或多个测试区的近端；和可加入偶联缓冲液的、位于末端样品流动区远端的偶联缓冲液添加区。
根据上述测试片例子，偶联缓冲液添加区的位置可与测试区相对，从而使得在将样品加至加样区的同时被加至偶联缓冲液添加区的偶联缓冲液，会在样品远端扩散前沿已扩散至远端扩散点并已开始向近端方向扩散之后，才达到远端扩散点。偶联缓冲液添加区的位置也可以与测试区相对，从而使得在将样品加至加样区的同时被加至偶联缓冲液添加区的偶联缓冲液，会在样品远端扩散前沿相对于测试区向近端扩散之后，才达到测试区。偶联缓冲液添加区可与测试区相对，从而使得偶联缓冲液能够在样品之前被加至测试片，并仍能在样品远端扩散前沿已扩散至远端扩散区、逆转方向并已开始向近端方向扩散之后，才达到远端扩散点。
根据上述任一测试片例子，测试片可含有1、2、3或更多的测试区，并且在测试区中固定有一种或多种对照结合剂。在一个例子中，测试片含有至少第一对照区，在第一对照区中固定有对照结合剂。任选地，测试区还可含有第二对照区，在第二对照区中固定有与第一对照区相同的对照结合剂，而第一对照区和第二对照区中对照结合剂的含量不同。
此外，根据任一上述测试片例子，测试片可以含有第二(种)分析物结合剂，该结合剂能够与分析物结合并扩散至一个或多个测试区。或者，第二分析物结合剂可以通过偶联缓冲液而输送至测试片上。第二分析物结合剂可以与样品中除了分析物之外的其他组份结合。或者，第二分析物结合剂也可以是不结合于样品中其他组份而只结合于分析物的试剂。
为了便于检测，第二分析物结合剂宜用可检测的标记物标记。如本文所述，本领域已知的大量可检测标记物都可使用。在一个优选例子中，第二分析物结合剂被附着于能够扩散至一个或多个测试区的颗粒上。该颗粒可以作为可检测标记物，也可以颗粒自身被可检测标记物所标记。
还提供了一种检测样品中分析物的方法。在一个例子中，该方法包括将样品输送至测试片，使得样品远端扩散前沿(a)向远端方向扩散至一个或多个测试区，其中至少一个测试区含有固定于其中的第一分析物结合剂，该第一分析物结合剂与样品中的分析物结合，(b)扩散至位于一个或多个测试区远端的末端样品流动区，改变方向和(c)扩散至位于一个或多个测试区近端的位置；将偶联缓冲液输送至测试片上位于末端样品流动区远端的位置，输送偶联缓冲液导致第二分析物结合剂向近端扩散通过末端样品流动区，并且在样品远端扩散前沿向一个或多个测试区的近端扩散之后扩散至一个或多个测试区，第二分析物结合剂与被固定于测试区的分析物结合；和检测被固定于测试区的第二分析物结合剂。
根据本方法，可在将样品加至测试片的同时、之前或之后，将偶联缓冲液加至测试片。相对于偶联缓冲液而言，样品被加至测试片的时间取决于样品达到末端样品流动区所需的时间，这反过来又取决于测试片的流动设计。
根据本方法，第二分析物结合剂也可被包含在测试片上输送偶联缓冲液的区域，这样，输送偶联缓冲液会导致第二分析物结合剂的扩散。或者，第二分析物结合剂可以被包含在测试片上并位于输送偶联缓冲液区域的近端，这样，输送偶联缓冲液会导致第二分析物结合剂的扩散。将偶联缓冲液输送至测试片，还包括将包含在偶联缓冲液中的第二分析物结合剂输送至测试片。
根据上述方法，测试区可包含其中固定有对照结合剂的第一对照区，输送偶联缓冲液导致对照剂向近端扩散，通过末端样品流动区而达到第一对照区，并且结合于其中所固定的对照结合剂。或者，测试区可包含第一和第二对照区并且各对照区含有不同数量的被固定的对照结合剂，输送偶联缓冲液导致对照剂向近端扩散，通过末端样品流动区而达到第一和第二对照区，并且结合于其中所固定的对照结合剂。
根据上述方法，用可检测标记物标记第二分析物结合剂会有助于检测第二分析物结合剂，而检测第二分析物结合剂包括检测可检测标记物。第二分析物结合剂可附着于颗粒。检测第二分析物结合剂包括检测颗粒。
根据上述任一例子，输送至测试片上的样品较佳地在一预定体积范围内，该范围是测试片的设计处理范围。该预定体积范围宜约为10-250微升，较佳地约为20-100微升，更佳地约为30-50微升，最佳地约为35-45微升。当样品在预定体积范围内被加至测试片上时，末端样品流动区的从近端至远端的距离可以被设计成具有短长度。例如，当样品以约35-45微升范围被加至测试片时，末端样品流动区的从近端至远端的长度可以约为1-25毫米，较佳地为2-15毫米，最佳地为3-10毫米。
根据上述任一例子，第一分析物结合剂宜不结合于样品除了分析物之外的其他组份。能够作为第一分析物结合剂的分子的种类包括(但并不限于)抗体、工程化蛋白、肽、半抗原、含有异源的抗原(抗原具有分析物结合位点)混合物的裂解物、配体和受体。在一个具体例子中，第一分析物结合剂是抗体或其片段。


图1是本发明一种侧流测试片的俯视图。
图2A-2H显示了本发明侧流测试片的操作方法。
图2A显示了样品正被加到测试片上。
图2B显示了样品在测试片中流动。
图2C显示了当样品在测试片中沿背离吸收区的方向流动了一段距离并达到末端样品流动区时的测试片。
图2D显示了当样品折返并流向吸收区时的测试片。
图2E显示了将缓冲液加至测试片上。
图2F显示了缓冲液在测试片中流向吸收区。
图2G显示了在测试片中缓冲液流过测试区。
图2H显示了在测试片中缓冲液流入吸收区。
图3A-3H显示了本发明侧流测试片的操作方法。
图3A显示了样品和缓冲液正被加到测试片上。
图3B显示了样品和缓冲液在测试片中流动。
图3C显示了当样品在测试片中沿背离吸收区的方向流动了一段距离并达到末端样品流动区时的测试片。
图3D显示了当样品折返并流向吸收区时的测试片。
图3E显示了缓冲液继续流向样品流。
图3F显示了缓冲液流过末端样品流动区。
图3G显示了在测试片中缓冲液流过测试区。
图3H显示了在测试片中缓冲液流入吸收区。
图4显示了一种测试片设计，其中加样区的位置邻近洗涤缓冲液添加区。
图5A-5C显示了各种盒式设计，其中装有本发明的测试片。
图5A显示了适用于图2A-2H所示测试片的盒式设计。
图5B显示了适用于图3A-3H所示测试片的盒式设计，其中加样区的位置远离洗涤缓冲液添加区，使得样品和洗涤缓冲液能够同时添加。
图5C显示了适用于图4所示测试片的盒式设计，其中加样区的位置邻近洗涤缓冲液添加区，测试区远离洗涤缓冲液添加区。
图6A显示了Abbott制造的FLEXPACKTMHP测试片的布局图。
图6B显示了图6A所示测试片的操作过程。
图7显示了图1所示侧流测试片的侧视截面图。
图8显示了实施例2中进行的II型疱疹的ReLIATM截流式测定的结果。
图9显示了实施例3中进行的II型疱疹的ReLIATM截流式测定的结果。
图10显示了实施例4中进行的Helicobacter pylori(幽门螺旋菌)的ReLIATM截流式测定的结果。
本发明涉及一种侧流测试片，该测试片能够使加至测试片的一部分样品从样品加样区流过一个或多个测试区并进入末端样品流动区，然后在无用户任何干扰的情况下改变方向，折返并流过一个或多个测试区而进入加样区。固定于至少一个测试区中的是第一分析物结合剂，该第一分析物结合剂能够与设计用测试片检测的样品中的分析物相结合。通过使一部分样品流过一个或多个测试区然后独立地返回并流向加样区，可以省去在一个或多个测试区与第二分析物结合剂接触之前洗涤一个或多个测试区的要求。还省去了确定何时让第二分析物结合剂扩散至一个或多个测试区的要求。如本申请下面将详细论述的那样，本发明测试片的自洗涤和自定时特征提供了多种优于以前测试片的明显优点。
本发明测试片的自洗涤和自定时特征，是通过将吸收区的位置与加样区相对，从而使得当一定体积的样品(在测试片的预定样品体积范围内)被加至测试片时，样品扩散前沿延伸通过一个或多个测试区并流至末端样品流动区。当样品达到末端样品流动区时，吸收区的吸收特性使得样品被反向吸回，通过测试区而流向加样区，并且最终被吸入吸收区。
图1是本发明一种侧流测试片100的顶视图。如图所示，测试片100分别具有近端102和远端104，而且能够被划分成几个不同区域。测试片含有加样区106，在此可以将样品加至测试片100。吸收区108位于加样区106的近端。一个或多个测试区110、112、114位于加样区106的远端。测试片100还含有位于一个或多个测试区110、112、114远端的末端样品流动区116。每个上述区域在液体扩散方面是互相连通的。
如图所示，测试片还含有偶联缓冲液添加区118，它位于末端样品流动区的远端。偶联缓冲液添加区118可以是偶联缓冲液被加至测试片的区域。或者，偶联缓冲液添加区118就是偶联缓冲液从更远处扩散而达到测试片的区域。
应注意，图1所示测试片的布局在设计上是线性的。然而，非线性的布局，例如图4所示的布局也可用于本发明的测试片。
图2A-2H显示了侧流测试片(比如图1所示的测试片)的操作方法。在用本发明测试片进行测试之前，先获得据信含有待检测分析物的液体样品。样品可包括能湿润测试片并且其粘度足以让样品移动通过测试片的任何液体。在一个优选例中，样品是水溶液(例如体液)。
图2A显示了样品120正被加至测试片100的加样区106。应注意，测试片被设计成用于体积在特定范围内的样品。更具体地，输送预定范围内的样品可导致样品向远端扩散越过测试区并进入末端样品流动区116，但是不超过末端样品流动区116(如图2D所示)。
如图2B所示，样品120在被加至测试片之后，开始在测试片上向近端和远端两个方向扩散。如图2C所示，样品120的远端前沿124扩散通过一个或多个测试区110、112、114而进入末端样品流动区116。如图2D所示，样品120的远端前沿124最终延伸至末端样品流动区116中的某个位点。
当加至测试片的样品体积在测试片的设计的预定体积范围内时，样品120的远端前沿124会到达远端扩散点，该远端扩散点对应于末端样品流动区116中最远的远端流动点。在该点，如图2E所示，吸收区108的毛细管作用将样品吸向近端，朝向吸收区108。当样品被吸入吸收区108时，样品的远端前沿124就向近端退回。
如图2A-2D所示，本发明的一个特征是控制样品在测试片中如何流动以及在何处流动。加至测试片的样品宜在测试片的设计处理的预定体积范围内。预定的体积范围宜约为10-250微升，较佳地约20-100微升，更佳地约30-50微升，最佳地约35-45微升。当加至测试片的样品在该范围内时，样品流会停在末端样品流动区中。
末端样品流动区的从近端至远端的距离可以被设计成具有短长度。例如，当样品以约35-45微升范围被加至测试片时，末端样品流动区的从近端至远端的长度可以约为1-25毫米，较佳地为2-15毫米，最佳地为3-10毫米。
第一分析物结合剂位于一个测试区(如测试区110)中，该第一分析物结合剂会结合于测试片设计检测的样品中的分析物。存在于流过测试区的样品部分中的分析物，会被第一分析物结合剂固定在测试区110中。
图2E显示了样品已到达末端样品流动区之后，将偶联缓冲液122加至测试片的偶联缓冲液添加区118。偶联缓冲液122可含有一种或多种不同的第二分析物结合剂，该第二分析物结合剂可结合于分析物并使固定于测试区的分析物被检测出。应注意，偶联缓冲液添加区118也可任选地含有一种或多种用于检测被固定的分析物的第二分析物结合剂。在这种情况下，加入偶联缓冲液122所起的作用是使一种或多种第二分析物结合剂开始扩散并通过测试区。
如图2F和2G所示，偶联缓冲液122流向测试片近端，并流向吸收区108，从而使一种或多种第二分析物结合剂移动通过测试区110、112、114，并且结合于被固定的分析物。
如图2H所示，吸收区108的毛细管作用使样品120扩散入吸收区108。同时，偶联缓冲液122继续向近端扩散，通过测试区110、112、114并进入吸收区108。任何没有被固定于测试区110、112、114的一种或多种第二分析物结合剂，会随偶联缓冲液122被携带进入吸收区108。
对于图2A-2H中所示的实例，应注意，应在样品120已到达测试区110、112、114之后，较佳地在样品已到达末端样品流动区116并已开始折返并朝吸收区108扩散之后，将偶联缓冲液122加至测试片。这使得流过测试区的样品120部分，可在没有偶联缓冲液的情况下与测试区中的第一分析物结合剂接触。
图3A-3H显示了本发明的另一种测试片设计和该测试片的操作方法。在这种实例中，样品和偶联缓冲液是同时加入的。为了使样品和偶联缓冲液能够几乎同时被加入，必须使偶联缓冲液在样品已经与测试区接触之后才到达测试区210、212、214。较佳地，偶联缓冲液到达测试区之前，样品扩散已开始折返通过测试区朝吸收区208扩散。
与图2A-2H所示的测试片设计相比，延迟偶联缓冲液到达测试区的时间，在该实例中是通过使偶联缓冲液添加区218和末端样品流动区216之间的距离更长而实现的。或者，人们可以使用让偶联缓冲液扩散速度更慢的材料。
图3A显示了样品220被加至测试片200的加样区206。与此同时，偶联缓冲液222被加到偶联缓冲液添加区218，与将样品加至测试片几乎同时。
如图3B所示，样品220一旦被加至测试片，开始在测试片中朝近端和远端扩散。与此同时，偶联缓冲液22也在测试片中朝近端和远端扩散。
如图3C所示，样品220的远端前沿224扩散通过一个或多个测试区210、212、214，到达末端样品流动区216。与此同时，偶联缓冲液222继续在测试片中向远端，朝向测试区扩散。
如图3D所示，样品220的远端前沿224最终延伸至末端样品流动区216中的某点。当样品在末端样品流动区216时，偶联缓冲液222还没有到达该区域。
如图3E所示，吸收区208的毛细管作用使样品向近端扩散，流向吸收区208。当样品被吸入吸收区208时，样品的远端前沿224向近端流动。第一分析物结合剂位于一个测试区(如测试区210)中，该第一分析物结合剂会结合于样品中测试片设计检测的分析物。存在于流过测试区的样品部分中的分析物，会被第一分析物结合剂固定在测试区210中。
图3F显示了偶联缓冲液222到达测试区。如图所示，当缓冲液222到达测试区时，样品的远端前沿224早已向近端流动，流出末端样品流动区216和测试区210、212、214。
如图3G和3H所示，吸收区208的毛细管作用使样品被吸入吸收区208。同时，偶联缓冲液222继续向近端扩散，通过测试区210、212、214并进入吸收区208。任何没有被固定于测试区210、212、214的一种或多种第二分析物结合剂，会随偶联缓冲液222被携带进入吸收区208。
加至测试片的偶联缓冲液222可含有一种或多种不同的第二分析物结合剂，该第二分析物结合剂可结合于分析物并使固定于测试区的分析物被检测出。或者，测试片也可包含位于末端样品流动区216远端的、含有一种或多种第二分析物结合剂的偶联物区。偶联缓冲液添加区218也可作为偶联物区。当一种或多种第二分析物结合剂被预载至测试片上时，偶联缓冲液222所起的作用是使一种或多种第二分析物结合剂开始扩散，通过测试区流向吸收区。
如图3A-3H所示，通过设计测试片的扩散路径使得偶联缓冲液不会在样品已扩散离开测试区之前到达测试区，偶联缓冲液就可在样品到达测试区之前被加至测试片。应注意，偶联缓冲液的扩散到达测试区的时间可以被大大延迟，这样人们可以在将样品加至测试片之前将偶联缓冲液加至测试片。
图4显示了本发明侧流测试片的另一种测试片设计。该测试片的操作与图3A-3H所述的操作相似。在图4中采用与图3A-3H相同的参考编号。如图4所示，加样区206的位置与偶联缓冲液添加区218相邻。这可使测试片的设计更紧凑，同时还允许同时添加样品和偶联缓冲液。
图4所示的测试片设计的一个特征，是样品和偶联缓冲液可同时被加至测试片的相同末端。还应注意，测试区210、212、214位于加样区206和偶联缓冲液添加区218的另一端。这使得测试区可被置于样品阅读器中，而加样区和偶联缓冲液添加区在样品阅读器外部。这样，又允许当测试片位于测试片阅读器中时，将样品和偶联缓冲液加至测试片。
图5A-5C显示了各种盒式设计，其中装有本发明的测试片。在每种盒式设计中，测试盒具有靠近测试片加样区206的加样孔240。测试盒还具有靠近测试片的偶联缓冲液添加区218的偶联缓冲液添加孔242。测试盒还具有靠近测试片测试区210、212、214的测试窗244。
图5A显示了适用于图2A-2H所示测试片的盒式设计。图5B显示了适用于图3A-3H所示测试片的盒式设计，其中加样区的位置远离偶联缓冲液添加区，使得样品和偶联缓冲液能够同时被添加至测试片。图5C显示了适用于图4所示测试片的盒式设计，其中加样区的位置邻近偶联缓冲液添加区，测试区远离缓冲液添加区。
应注意，对于图2-4而言，本发明测试片的特征是测试片本身能够使测试片上的测试区在一段时间内暴露于一部分样品，然后在偶联缓冲液到达测试区之前使样品扩散离开测试区。这个特征是通过将下列因素(1)与因素(2)、(3)相匹配而实现的(1)吸收区的位置与加样区相对，(2)测试片在加样区和末端样品流动区之间的吸收能力，(3)加至测试片的样品体积。如果加入过多样品，样品会扩散逸出末端样品流动区。如果加入样品过少，则样品不能在测试片中扩散足够距离到达测试区。
使测试区在限定时段内暴露于样品，然后使样品离开测试区这一测试片的能力，使得测试片不依赖于定时，这提高了测试片的精度且便于使用。例如，如实施例2详细描述的那样，测试结果与偶联缓冲液何时加至样品无关。因此该测试片不需要小心监测何时应加入偶联缓冲液。在这方面，本发明消除了在加入样品之后应将偶联缓冲液加至测试片的时间之窗。
现在结合图1，描述将一定体积的样品加至测试片从而控制样品如何在测试片中扩散的动力学。如前所述，图1显示的测试片分别具有近端102和远端104，并且被分成数个独立的区域。测试片含有加样区106，在此可以将样品加至测试片。吸收区108位于加样区106的近端。测试区110位于加样区106的远端。末端样品流动区116位于测试区110的远端。偶联缓冲液添加区118位于末端样品流动区116的远端。
为了便于阐述，假设测试区110含有第一分析物结合剂，而偶联缓冲液添加区118含有用可检测标记物标记的第二分析物结合剂。还假设测试片被设计成30微升的样品会使样品扩散但不会超过测试区110。同时，50微升的样品体积会使样品扩散至末端样品流动区116的远端。
如果加至测试片的样品在30-50微升体积范围内，则样品的远端前沿将扩散通过测试区110。样品远端的前进将停在末端样品流动区116中。在到达测试区110的部分样品中的分析物，会结合于第一抗体并被固定在测试区110中。样品中的其他组份将不会结合于第一抗体，因为第一抗体对分析物有选择性。然后，样品折回，按近端方向通过测试区110流向吸收区108。当加入偶联缓冲液时，偶联缓冲液使第二分析物结合剂扩散通过测试区110，在此处第二分析物结合剂结合于被固定在测试区110中的分析物。因为在缓冲液到达测试区110之前样品已扩散离开测试区110，因此不存在任何原本会结合于第二分析物结合剂的样品成分。因此，为了结合于第二分析物结合剂，样品中的待检测分析物不必与样品中的其他物质竞争。
如果加至测试片的样品体积小于30微升(例如25微升)，样品将不能扩散至测试区110。结果，样品中的分析物不能到达测试区110并结合于第一抗体。当加入缓冲液时，第二分析物结合剂会随偶联缓冲液的扩散而被携带，并通过测试区110而不被固定，因为在测试区中不存在分析物。
如果加样的样品体积大于50微升(例如55微升)，样品会扩散通过测试区110并通过末端样品流动区116进入偶联缓冲液添加区。一些分析物会结合于测试区110中的第一分析物结合剂并被固定。同时一些分析物会结合于偶联缓冲液添加区118中的第二分析物结合剂，然后才折回并结合于测试区110中的第一分析物结合剂。因为空间位阻效应，结合了双拷贝第二分析物结合剂的分析物不会结合于第一分析物结合剂。而且，在分析物已结合于第二分析物结合剂之后，就难以使分析物结合于第一分析物结合剂。结果，测试片的灵敏度会下降，如果分析物在结合于第一分析物结合剂之前就结合于第二分析物结合剂。到达偶联缓冲液添加区118的部分样品中的其他组份，也可能结合于第二分析物结合剂。这些其他组份会与分析物竞争与第二分析物结合剂的结合。
通过控制加样的样品体积，从而(1)使分析物暴露于第一分析物结合剂之后才让固定化的分析物暴露于第二分析物结合剂，和(2)使第二分析物结合剂在暴露于样品中的其他组份之前不暴露于分析物，可以减低非特异性结合。这样大大提高了分析灵敏度和分析物检测精度。
如上所述，本发明测试片的两个优点是自洗涤和自定时特性。为了解释这些特性的重要性，现在将与Abbott制造的FLEXPACKTMHP测试片进行比较(示于图6A和6B)。
图6A显示了这种测试片的布局图。如图所示，该测试片含有两个独立区段310、312，它们通过铰链314互相连接。右侧的区段310包括测试片316，测试片316具有加样区318、测试区319、限制线320和偶联缓冲液转移垫片322。左侧的区段312包含吸收垫片324(它与加样区318相对)、偶联缓冲液添加垫片326(它与偶联缓冲液转移垫片322相对)、和测试窗328(它与测试区319相对)。吸收垫片324、偶联缓冲液添加垫片326和测试窗328的位置并列，使得第一区段310和第二区段312相互接触时，吸收垫片324会与加样区318接触而偶联缓冲液添加垫片326会与偶联缓冲液转移垫片322接触。此外，当第一区段310和第二区段312相互合拢时，可通过测试窗328观察测试区319。
图6B显示了图6A所示测试片的操作过程。如图所示，偶联缓冲液330被加至偶联缓冲液添加垫片326。偶联缓冲液添加垫片含有能够结合于待检测样品中分析物的第二分析物结合剂(如抗体)。第二分析物结合剂用可检测标记物标记，这使得第二分析物结合剂可以显现。第二分析物结合剂并不是对分析物特异的，因此可以结合于样品中的其他组份。
然后采集样品322，并将其加至加样区318。一旦加入，样品在测试片316上扩散，从加样区318扩散通过测试区319。测试区319含有被固定的第一分析物结合剂(如抗体)，它可选择性地结合于样品中测试片设计检测的分析物。当样品穿过测试区319时，样品中的分析物会结合于第一分析物结合剂并被固定在测试区319中。
当样品的扩散前沿到达限制线320时，用户要将第一区段310和第二区段312合在一起。将第一区段310和第二区段312合在一起，使得吸收垫片324将样品吸回加样区318。同时，偶联缓冲液被从偶联缓冲液添加垫片326转移至偶联缓冲液转移垫片322。偶联缓冲液从偶联缓冲液转移垫片322扩散出来，通过测试区319。储存在偶联缓冲液添加区318中的第二分析物结合剂会与偶联缓冲液一起扩散，并与测试区319中被固定的分析物接触。第二分析物结合剂一旦被固定在测试区319，那么通过观察第二分析物结合剂上的可肉眼检测的标记物就可以检测分析物。
从对FLEXPACKTMHP测试片操作过程的上述描述可以看出，必须确定样品何时到达限制线320，然后才让偶联缓冲液从偶联缓冲液添加垫片326转移至偶联缓冲液转移垫片322并流向测试区319。还必须有确定加样区318和吸收垫片324接触的步骤，以便样品被吸离测试区319。本发明的测试片设计，例如在图2-4所示的设计，消除了监视测试片已确定何时开始将样品从测试区移去这一要求。此外，因为样品会自动退回，因此在加入偶联缓冲液时人们不必小心监视测试片。相反，如实施例2所示，用本发明测试片获得的测试结果与在样品扩散离开测试区后偶联缓冲液何时到达测试区无关。
本发明的侧流分析(或侧流测定)可用于各种不同用途。例如，该分析可用于分析人类疾病，例如传染性疾病、或任何其他涉及可识别表位的人类疾病(如癌症、自身免疫疾病、心血管病症和病理)。该分析还可用于兽医、食品测试、农业和精细化学应用。本发明的侧流分析可用各种不同方法进行，包括使用侧流分析测试设备，例如1998年11月23日申请的专利申请No.09/199,255中所述的设备，该文献在此引用作为参考。在一个优选例中，侧流分析测试设备包括可从PraxSysBioSystems(San Ramon，CA)得到的ReLIATM测试设备。
1、制造本发明的测试片现在更详细地描述用于制造本发明测试片的方法和材料。应注意，测试片的具体构造可以变化，这取决于意图用测试片来进行的具体测试。在实施例之外制造测试片的变动方法，也落于本发明范围之中。
图7显示了图1所示侧流测试片的侧视截面图。如图7所示，测试片100可包括背衬片402，其长度与测试片相同。膜片404位于背衬片402之上，并作为测试片的扩散通路。吸收垫片408在吸收区108且位于膜片404之上，而吸收区位于测试片的近端。样品垫片406位于膜片404之上且位于吸收垫片408的远端。可用粘合剂409将样品垫片406粘于膜片404。在膜片404上可形成位于样品垫片406远端的一个或多个测试区410、412、414。偶联缓冲液添加垫片416在膜片404上方，位于测试区410、412、414的远端且位于末端样品流动区116的远端。在测试区上方有一保护性盖片418。为了让夹带入流体前沿的气泡逸出，在测试区和偶联物区之间留有一个没有被保护性盖片418覆盖的空隙。保护性盖片418可被更广泛地置于膜片404上方，以便保护测试片的其他部分。
背衬片可以用任何稳定的、无孔的材料制成，其强度应足以支承材料和粘于其的测试片。因为许多测定用水作为扩散介质，因此背衬片较佳地是基本上不透水的。在一个优选例中，背衬片是用聚合物膜制成的，更佳地是用聚氯乙烯膜制成的。
膜片可以用任何材料制成，只要该材料有足够孔隙度从而允许在表面和内部发生流体的毛细管作用。膜片应有足够的孔隙度，从而允许涂有抗体或抗原的颗粒移动。膜片还可被含待检测分析物的样品中所用的液体润湿(例如，对于水性液体具有亲水性，对于有机溶剂具有疏水性)。通过例如在美国专利No.4,340,482或No.4,618,533中所述的方法(这些方法描述了将疏水表面转变成亲水表面)，可以改变膜的疏水性从而使膜具有亲水性以便用于水性液体。可用于制造膜片的材料例子包括纤维素、硝酸纤维素、乙酸纤维素、玻璃纤维、尼龙、聚电解质离子交换膜、丙烯共聚物/尼龙、和聚醚砜(polyethersulfone)。在一个优选例中，膜片是用硝酸纤维素制成的。
吸收垫片可以用任何能吸收作为样品和缓冲液的液体的材料制成。吸收垫片的吸收能力应足够大，以便吸收添加至测试片的液体。适用于吸收垫片的材料的例子包括纤维素和玻璃纤维。
缓冲液添加垫片可用任何吸收性材料制成。可使用的材料例子包括纤维素、硝酸纤维素、乙酸纤维素、玻璃纤维、尼龙、聚电解质离子交换膜、丙烯共聚物/尼龙、和聚醚砜。
如前所述，偶联缓冲液添加垫片可作为偶联物垫片并含有被可检测标记物标记的试剂，该试剂可结合于样品中待检测的分析物。或者，测试片可含有与缓冲液添加垫片分开的偶联物垫片，在该偶联物垫片中含有被可检测标记物标记的、能结合于样品中待检测分析物的试剂。
保护性盖片可用任何材料制成，只要该材料不透水而且较佳地是半透明或透明的。保护性盖片可以是单层或多层。优选的用作保护性盖片的材料包括透光材料，例如聚酰胺、聚酯、聚乙烯、丙烯酸类材料、玻璃或类似的材料。保护性盖片可以是透明或不透明的，这取决于所用的检测方法。在一个优选例中，保护性盖片是透光透明的聚酯。
2、与本发明测试片一起使用的分析方法本发明测试片可用于大量不同的侧流分析方法，而这些分析方法涉及使用两种都能结合于待检测分析物的分析物结合剂。至少一种结合剂可选择性地结合于分析物。更具体地，一种结合剂应能结合于分析物而不结合于样品中的其他组份。
如本文所用，术语“分析物”指待用分析测试片检测以及可任选地被定量测定的、样品中的任何组份(如分子、化合物、或其聚集体)。分析物的例子包括蛋白质，如激素或其他分泌蛋白质、酶和细胞表面蛋白；糖蛋白；肽；小分子；多糖；抗体(包括单克隆抗体或多克隆抗体及其片段)；核酸；药物；毒素；病毒或病毒颗粒；细胞壁组份；或其他具有表位的化合物。
第一和第二分析物结合剂可以是任何能够结合于待检测分析物的物质。有各种不同类型的分子可用作分析物结合剂，其中包括例如抗体、工程化蛋白、肽、半抗原、或含有抗原(该抗原具有分析物结合位点)的异源混合物的裂解物。P.Holliger等人，Trends in Biotechnology 137-9(1995)；S.M.Chamow等人，Trends inBiotechnology 1452-60(1996)。如果待检测分析物是配体，那么可使用结合于该配体的受体，反之亦然。在一个具体例子中，第一和/或第二分析物结合剂是可结合于分析物免疫原性部分的抗体。
应注意，第一和第二分析物结合剂中应至少有一种能够结合于分析物而不结合于待分析样品中的其他组份，这种分析物结合剂在此被称为分析物选择性结合剂。在一个例子中，被固定在测试区中的第一分析物结合剂是分析物选择性结合剂，而用可检测标记物标记的第二分析物结合剂能够非特异地结合于分析物。在另一例子中，被固定在测试区中的第一分析物结合剂能够非特异地结合于分析物，而用可检测标记物标记的第二分析物结合剂是分析物选择性结合剂。在另一例子中，第一和第二分析物结合剂都是分析物选择性结合剂。
分析物选择性结合剂的例子包括抗体(单克隆抗体、多克隆抗体及其片段)，它们仅对特定类型的生物分子(如蛋白质或受体)有狭窄的结合亲和力。
连于第二分析物结合剂的可检测标记物包括大量不同物质，只要标记物能够被检测。可检测标记物的例子包括(但并不限于)颗粒、发光标记物；比色标记物、荧光标记物；化学标记物；酶；放射性标记物；或射频标记物；金属胶体；和化学发光标记物。常用检测方法的例子包括(但并不限于)光学方法，如测量光散射、单反射、光度计或光电倍增管；放射性(用盖革计数器等进行测量)；导电性或电介质(电容)；电化学法检测所释放的电活性物质，如铟、铋、镓、碲离子[如用Hayes等人(Analytical Chem.661860-1865(1994)所述的方法]，或亚铁氰化物[如用Roberts和Durst(Analytical Chem.67482-491(1995)所提出的方法。其中通过在检测区滴加洗涤剂，使包裹在脂质体中的亚铁氰化物被释放出，然后用电化学法检测释放的亚铁氰化物]。其他常规方法只要合适，也可使用。
可能会需要用同一测试片来分析两种或多种不同的分析物。在这种情况下，在同一测试片上采用不同的可检测标记物会是有利的，其中每种可检测标记物检测不同的分析物。例如，不同的可检测标记物可连于不同的分析物选择性结合剂。不同的可检测标记物可以是在不同波长发出荧光的不同荧光剂。
当用同一测试片检测两种或多种不同的分析物时，可任选地在测试片上形成独立的针对各种待检测分析物的测试区。对所有分析物可以使用相同的可检测标记物。或者，如上所述，可对不同的分析物使用不同的可检测标记物，以防一个测试区与其他测试区相混淆。
在一个优选例中，可检测标记物是颗粒。可使用的颗粒例子包括(但并不限于)胶体金颗粒；胶体硫颗粒；胶体硒颗粒；胶体硫酸钡颗粒；胶体硫酸铁颗粒；金属碘酸盐颗粒；卤化银颗粒；二氧化硅颗粒；胶体(水合)金属氧化物颗粒；胶体金属硫化物颗粒；胶体硒化铅颗粒；胶体硒化镉颗粒；胶体金属磷酸盐颗粒；胶体金属铁酸盐颗粒；涂有有机或无机层的上述任一种胶体颗粒；蛋白质或肽分子；脂质体；或有机聚合物乳胶颗粒，例如聚苯乙烯乳胶珠。
一类优选的颗粒是胶体金颗粒。胶体金颗粒可用任何常规方法制造，例如总结于G.Frens，1973 Nature Physical Science，24120(1973)中的方法。其他方法描述于美国专利No.5,578,577、5,141,850、4,775,636、4,853,335、4,859,612、5,079,172、5,202,267、5,514,602、5,616,467、5,681,775。
颗粒大小的选择会影响一些因素，例如总溶胶试剂及其偶联物物的稳定性、偶联物垫片释放颗粒的效率和充分性、反应的速度和充分性。此外，颗粒表面积会影响结合分子之间的空间位阻。颗粒大小还应根据膜片的孔隙度进行选择。颗粒宜足够小，从而能因偶联缓冲液的毛细管作用而沿膜扩散。
颗粒可以被标记，以协助检测。标记物的例子包括(但并不限于)发光标记物；比色标记物如染料；荧光标记物；或化学标记物，如电活性剂(electroactiveagents)(如亚铁氰化物)；酶；放射性标记物；或射频标记物。
存在于测试片上的颗粒数目可以改变，这取决于颗粒的大小和组成、测试片和膜片的构成成分、以及分析测试的灵敏度水平。颗粒数目的范围通常约为1×109-1×1013个颗粒，尽管也可使用低于1×109个颗粒。在一个优选例中，颗粒数目约为1×1011个颗粒。
3、对照测试区如图1所示，在测试片上可包含多个测试区110、112、114。每个测试区的位置使得自动的或半自动的分析仪器，或者观察者，能够测定侧流分析的确定结果。
如前所述，固定在至少一个测试区中的是第一分析物结合剂，该第一分析物结合剂能够结合于测试片设计检测的样品中的分析物。在某些例子中，让某些其他测试区含有一个或多个对照区是有利的，对照区中固定有一种或多种对照结合剂。能够结合于对照结合剂的对照剂可以位于测试片上的各种不同位置，或者可以在进行测试时被加至测试片上。对照剂较佳地被可检测标记物(例如上述的可检测标记物)所标记，以利于检测对照剂与固定在对照区中的对照结合剂之间发生的结合。
对照剂和对照结合剂可以结合使用，以实现各种对照功能。例如，对照结合配对(pairs)可用于验证样品和偶联缓冲液在测试片上的扩散是否正常。对照结合配对还可被用作内部标准，使得分析物测量结果能够在不同测试片之间进行比较。这可用于修正测试片-测试片之间的差异。用基于例如对测试片统计采样而得出的外部对照来进行这种修正是不切实际的。此外，通过使用对照结合配对，可以减小不同测试片在各个批次和各次使用之间的差异。此外，如下所述，还可减低非特异性结合的影响。在使用外部的非测试片对照时，所有这些修正都是难以实现的。
可用作对照结合配对成员的各种不同物质，是本领域中已知的。例如，对照结合配对的至少一个成员可以是天然存在的或工程改造的蛋白质。对照结合配对也可以是受体-配体的配对。此外，对照结合配对的至少一个成员可以是偶联于对有关分析物非特异的蛋白质之上的抗原、其他有机分子、或半抗原。有关对照结合配对的其他合适成员的描述，可在美国专利No.5,096,837中找到，并且包括IgG、其他免疫球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、其他白蛋白、酪蛋白、和球蛋白。
对照剂-对照结合剂配对的有利特性包括(但并不限于)整体稳定性、对有关分析物的非特异性、测试的重现性和可预测性、分子大小、相互结合的亲和力。
在一个优选例中，对照结合配对的成员并不与可能存在于测试片上的任何东西(例如来自样品的东西)结合。在一个例子中，对照结合剂包括兔抗-二硝基苯酚(抗-DNP)抗体，而对照剂包括偶联于BSA(牛血清白蛋白)的二硝基苯酚。
在一个优选例中，对照剂和沿测试片扩散的第二分析物结合剂两者都被附着在一种颗粒上。附着可以是非特异性的吸附，也可以是常规的化学偶联。或者，可以使用非共价的结合系统，例如生物素-亲和素或甚至对第二分析物结合剂特异的抗体，使分析物结合剂附着于颗粒。双官能或多官能试剂也可用于将第二分析物结合剂和对照剂连于颗粒。
连于各颗粒的第二分析物结合剂和对照剂的数目可以变化，这取决于对具体的测试是否合适。例如，可将双份第二分析物结合剂和一份对照剂连于各颗粒。或者，将一份第二分析物结合剂和二份对照剂连于各颗粒。根据采用三者的具体测试情况，第二分析物结合剂对照剂颗粒之间的其他不同比例也可使用，这些不同的变化形式也在本发明范围之内。
在一个优选例中，测试片包含一个以上的对照区，并且被用于产生一标准曲线，而大量不同的分析物测量结果就可与该标准曲线进行比较。该例子在1998年11月23日提交的专利申请No.09/198,118中有更详细的描述，该文献在此引用作为参考。让测试片具有一个以上对照区，使得侧流分析能够比常规侧流分析具有更广的动态量程。在优选例中，如下所述，将具有2个、3个或更多对照区的测试片与相对比例法结合使用，从而可以将检测到的对照结合配对的数量映射到同一标尺，并根据该标尺得出被检测分析物的数量。
在一个优选例中，测试片有至少一个高对照区和至少一个低对照区。两个区之间的差异通常为一种浓度。在高对照区中的对照剂浓度大于在低对照区中的对照剂浓度。因此，在高对照区中的对照结合配对的数量高于低对照区。在给定对照区中的对照结合配对物的数量能够被映射到同一测量标尺上(并可根据该标尺得出分析物的数量)的例子中，可以通过高和低对照区中结合配对物的数值而绘制标准曲线。
在其他例子中，可存在2个以上对照区。这样所产生的曲线能更好地反映测试中在检测的分析物数量和被映射数量的测量值之间的非线性现象(如下所述)。尽管这些非线性现象原本会影响假定较为线性关系的测试，但是通过使用多个对照区可以对其进行校正。可以使用2个、3个或更多的对照区。
在另一实施例中，一个单个对照区可含有一种以上的对照剂。这在有一组以上偶联于检测剂的分析物非特异性试剂和分析物结合剂情况下是有用的。例如，当需要在同一测试片上分析两种或多种感兴趣的分析物时，可以制备两组偶联于检测剂的分析物非特异性试剂和分析物结合剂。对于每组可使用不同的检测剂，从而可以区分感兴趣的两种不同分析物的测量结果。在这种情况下，可能需要使用包含不同对照剂或对照结合配对的对照区。
对照区可位于一组测试区中的各种位置。应注意，测试区可位于测试片的各种位置，这取决于本发明测试片的流动设计。
可按图2A-2H和3A-3H所述的相同方式，用包含一个或多个对照区作为测试区域一部分的测试片进行测试。应注意，测试片或偶联缓冲液中的一者，应包含可结合于被固定的对照结合剂的对照剂，例如在图2A-2H中的测试区112和114以及图3A-3H中的测试区212和214。当加入偶联缓冲液时，对照剂会随偶联缓冲液一起扩散并结合于被固定在对照区中的对照结合剂。
在检测固定于测试区中的第二分析物结合剂数量的同时，被固定在对照区中的对照剂的数量也被检测。如上所述，较佳地用可检测标记物对对照剂和第二分析物结合剂进行标记，以便于检测。在各测试区中的可检测标记物的数量，可以轻易地用本领域已知的各种技术加以确定，其中所用的技术取决于所用的可检测标记物类型。常见的检测技术例子包括光学方法(光散射、单反射、光度计或光电倍增管)；放射性；导电性；电介质电容；电化学法检测所释放的电活性物质等，这在上面已有描述。
一旦在各测试区中已检测出可检测标记物的数量，那么这些测量值就可用于检测并且更佳地可用于定量所存在的分析物数量，较佳地还通过对照区中的可检测标记物数量校正测试片。例如，当采用高和低对照区时，被固定在高和低对照区中的对照剂数量，可用于确定相对于高和低对照区而言的第二分析物结合剂的数量。接着，这些相对强度测量值可用于更精确地确定存在于测量体积中的分析物拷贝数。
使用多个对照区的一个特征是能够产生用于测量分析物的相对标尺。一旦可检测标记物的数量被定量，那么这些数量接着就可被映射到另一测量标尺上。例如，尽管测量分析物所得出结果可基于分析物的绝对测量值进行测量，但是以其他单位所表示的测量结果可能更有意义，例如相对于对照区的相对强度(在本文被称为相对强度或RI)。结果还可表示为测量体积中存在的分析物拷贝数。将检测的分析物数量映射到其他测量标尺上是一种报告本发明测试结果的优选例子。
例如，测试结果可被映射到相对标尺上。对于内部对照，使用相对标尺(例如相对强度(RI))，可以将测得的分析物绝对值转化为RI值。在一个优选例中，低对照的RI值被定为1而高对照的RI值被定为3，尽管这些对照的绝对值之比并不如此。在一个优选例中，绝对值之比至少约为5∶1，而RI之比约为3∶1。通过这样做法，在各测试片中影响测量绝对值的变化因素，会导致标准曲线在Y轴上下波动，但是对于沿X轴绘制的RI值的影响却较小。这会全面地减小报告数据的可变幅度，即会表现为“负增益”。
例如，如果在分析物的测量数量和分析物的报告数量之间存在负增益，那么在分析物测量数量上的大变化会转化为分析物报告数量上的较小变化。尽管分析物测量数量的内在差异没有改变，但这种方法在某些情况下是有用的。负增益效应减小了某些测试差异度，并且与简单地报告测量绝对值相比，可用于提高测试报告结果的重复性。
除了在连续标尺上报告测试结果(或者直接地报告所检测分析物的数量，或者将检测的分析物数量映射到标尺再间接地报告测量标度)之外，本发明测试方法还可用于“截止”式分析。如果可检测标记物在分析物结合区被检测，那么可将测得的可检测标记物数量与截止值相比较。截止值是高于该数值时测试就被认为阳性的数值；即，感兴趣分析物在液体样品中的存在达到了某种统计置信度。低于截止值时，测试通常被认为非阳性--或者感兴趣分析物并不存在，或者本发明侧流分析不能检测到它的存在。尽管可根据直接测量值(如测得的分析物数量)来建立截止关系，但是如果数据以间接或相对标度来表示的话，那将更有意义。
阴性值和阳性值之间的区别越大，截止式侧流分析越有利。阴性值是当有关分析物在统计意义上不存在时在连续标尺上的报告值。与之相反，阳性值是当有关分析物在统计意义上存在时在连续标尺上的报告值。当这些数值收敛时，能够在统计上区分阳性和阴性的可能性就下降。
在截止处的准确度上升的截止式侧流也是有利的。当在选定的截止处的变异度较小时，阳性被准确地定为阳性以及阴性被准确地定为阴性的可能性就增加。
测试结果可以被变换成上述的“相对”标度或“绝对”标度。绝对标度是以实际物理单位测量的，例如分析物的拷贝数/每毫升液体。用绝对标度表示的测量值，在测试某些疾病或病症是有优选的，例如测试癌症指标时。在这些优选例中，结果可用例如ng/ml之类的单位表示。因此，对照区具有指定浓度值的对照剂。作为相对测量概念的延伸，可以测量一系列已知分析物浓度的标准物的反射强度(density of reflectance，DR)，并如上所述计算相对于对照的强度(相对强度值)。然后，可将RI值对分析物浓度进行作图，以建立标准曲线，在该曲线中各RI值对应于有关分析物的某个浓度值。然后，样品的RI可在这一数值对应的标准曲线上解读，得到用所需单位表示的结果。
如果可能，采用一种既作为分析物结合剂又作为对照剂的单一试剂是有好处的。与分析物结合剂和对照剂是不同试剂的测试方法相比，采用单一试剂的测试方法可使阴性和阳性样品组的测量值分得更开，并且截止准确度也更高。
许多环境因素会影响侧流分析的绝对反应性，其中包括(但并不限于)制造方面的变数、操作者所引入的变数、环境所引入的变数和样品效应。使用常规的侧流分析时，任何这些因素会抑制或可能提高一个测试片相对另一测试片的反应性，从而导致假阴性或假阳性结果。对于这些或其他变数没有对照，会导致很不准确、无重复性、缺乏敏感度和缺乏测试特异性。
侧流分析还会受到多种干扰，它们会影响分析物结合剂或对照剂与测试区之间结合的绝对量。影响因素包括(1)从偶联物垫片上释放第二分析物结合剂或对照剂方面的差异，(2)装置和装置之间在分析物结合群与测试片的非特异结合方面的差异，(3)在测试过程中，因测试片或膜片材料的孔径或分析物结合剂的非特异聚集而导致的分析物结合群通过或沿测试片移动方面的差异。因此，由这些或其他因素而导致的结合绝对测量值的差异，会在常规侧流分析中高得无法接受。
通过使用一种包含了第二分析物结合剂和对照剂的单一试剂，可以减小这些类型的变数。与常规双群式(two-population)分析相比，已暴露于对照剂的侧流分析基质的任何部分，也更可能暴露于第二分析物结合剂。与常规双群式分析相比，任何阻碍或防止对照剂沿着或通过侧流基质运动的机制，也更可能阻碍或防止第二分析物结合剂的运动。第三，可以选择对照剂以减少第二分析物结合剂的非特异结合量。
还可通过修饰分析物检测基质的疏水性/亲水性来降低非特异性结合。分析物检测基质颗粒的聚集“自缔合”现象(这会阻碍基质在测试片上的运动)，也可通过选择性质合适的对照剂而加以减少。最终的好处在于，因为只需制备更少的试剂，所以可降低制造成本。
如本文所述，在侧流分析的实践中多个对照区可提供许多潜在好处。额外的对照区可用于扩展分析标准曲线的动态量程，而不论曲线是线性还是非线性的。多个对照区还可用于确定在给定测试中是否存在前带或高剂量弯曲效应(hookeffect)。如果存在这种效应，那么可建议用户稀释样品以便准确地测定有关分析物的浓度。
实施例1.测试片的构造在该实施例中，描述了具有图1和7所示设计的测试片的构造。对微孔SRHF背衬硝酸纤维素片(4.8厘米×20厘米)(膜片404)进行涂覆，即用Bio Dot XYZ3000分配平台并且生物喷口(Biojet)的工作频率为120Hz的情况下，以20.83nl/滴和0.5μl/cm将一个抗原条带(测试区410)和两个对照条带(测试区412、414)按纵向涂于硝酸纤维素404上。然后，硝酸纤维素片404在强风温箱中于37℃干燥1小时，在含10mg/ml BSA、1％(w/v)PEG 8000、3％(w/v)甘露醇、0.3％(w/v)明胶、0.01％(w/v)叠氮化钠和0.05％(w/v)十二烷基硫酸钠的PBS溶液中封闭15分钟。接着在强风温箱中于37℃再干燥1小时。涂覆的硝酸纤维素片404以干燥形式在室温下贮藏于箔袋中。
Gelman 8980玻璃纤维垫片被用作偶联缓冲液垫片416，通过将其浸入PBS溶液(含10mg/ml BSA、1％(w/v)Triton X-100、2.5％(w/v)蔗糖和0.3％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K-30)而预封闭，然后在强风温箱中干燥2小时。用Bio Dot XYZ3000分配平台并且单生物喷口的工作频率为120Hz的情况下，以104.17nl/滴和2.5μl/cm将PBS(含10mg/ml BSA、1％(w/v)Triton X-100、2.5％(w/v)蔗糖和0.3％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K-30)中的偶联物溶液，按纵向涂于预封闭过的偶联缓冲液垫片416上。在偶联缓冲液垫片416上涂覆偶联物的图案是每厘米2-6线，并且在每个3厘米×10厘米的垫片上涂覆3个图案。涂覆后的偶联缓冲液垫片416在2托和室温下真空干燥2小时，然后切割成1厘米×20厘米的小块，每块含一个图案。
测试片是这样制备的将一片4.8厘米×20厘米的背衬硝酸纤维素片404、一块1厘米×20厘米的涂覆过的偶联缓冲液垫片416和一片1.2厘米×20厘米Gelman Cytosep 1662片406固定在一片涂有粘合剂且厚0.010″的6厘米×20厘米乙烯背衬片402上(G&L Precision Die Cutting)。用双面胶409将0.5厘米宽的加样垫片406固定在硝酸纤维素404上。用G&L Precision Die Cutting的鼓式切片机，从组装好的片材上切下0.5厘米宽的测试片。为了将测试片装入测试盒(如图5A所示)，将测试片置于容器的下半部分，再将0.6厘米×1.5厘米的吸收垫片408置于测试片的上方，然后将容器上半部分的插脚对准下半部分的插孔，将容器压紧合二为一。
2.分析测试片对缓冲液添加时间和体积的依赖性用于该实施例的测试片是如实施例1中所述进行制备的。测试片在高对照条带(测试区414)涂有800微克/毫升的兔抗-二硝基苯酚(抗-DNP)，在低对照条带(测试区412)涂有200微克/毫升的兔抗-二硝基苯酚(抗-DNP)，并且在测试区410涂有II型疱疹gG2抗原(在280纳米处的光密度约为0.115)。这些条带在测试片上的次序是抗原条带最接近偶联缓冲液垫片，低对照区位于抗原条带和高对照区之间，而高对照区离偶联缓冲液垫片最远且离吸收垫片最近。
用A蛋白-OMNITM偶联物[A蛋白/BSA-DNP(2×/0.5×)]-8.5nm金，来涂覆预封闭的偶联缓冲液垫片416，其中涂覆液的制各是通过将3份体积的偶联物原液(OD520约为63)与1份体积的PBS(含40毫克/毫升BSA、4％(w/v)Triton X-100，10％(w/v)蔗糖和1.2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K-30)和0.15份体积的20×PBS混合而成的。如实施例1所述，将混合物涂在预封闭的偶联缓冲液垫片上。
测试是这样进行的将测试盒置于实验室长台上，然后将体积为32.5微升、35微升、40微升、45微升或50微升的II型疱疹的中度阳性样品705145，通过测试盒的加样孔而加至样品垫片406。然后，在样品达到末端样品流动区116后0分钟、5分钟或15分钟时，将125微升偶联缓冲液(PBS，10mg/ml BSA、0.1％叠氮化钠和2mM EDTA)加至偶联缓冲液添加区416。接着，将包含了测试片的测试盒置于的ReLIATM仪上，该仪器已被设置好可运行检测抗II型疱疹抗体的ReLIATM分析并读取数据。测试片温度被设为40℃，并在10分钟后对测试片进行读数。
如图8所示，对于35-45微升的样品体积和高达15分钟(测量的最长延迟时间)的孵育时间而言，II型疱疹的ReLIATM截流式测定结果与加入的样品体积和逆流开始之前的孵育时间都无关。在该体积和孵育时间范围内，测试结果的变差系数(CV)为12.5％。
3.II型疱疹的测试用于该实施例的测试片在高对照条带涂有800微克/毫升的兔抗-二硝基苯酚(抗-DNP)，在低对照条带涂有200微克/毫升的兔抗-二硝基苯酚(抗-DNP)，并且在抗原条带涂有II型疱疹gG2抗原(在280纳米处的光密度约为0.115)。这些条带在测试片上的次序是，抗原条带最接近偶联缓冲液垫片，低对照区位于抗原条带和高对照区之间，而高对照区离偶联缓冲液垫片最远且离吸收垫片最近。如实施例1所述，对硝酸纤维素片进行涂覆并制备测试片。
用A蛋白-OMNITM偶联物[A蛋白/BSA-DNP(2×/0.5×)]-8.5nm金，来涂覆预封闭的偶联缓冲液垫片，其中涂覆液的制备是通过将3份体积的偶联物原液(OD520约为63)与1份体积的PBS(含40毫克/毫升BSA、4％(w/v)Triton X-100，10％(w/v)蔗糖和1.2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K-30)和0.15份体积的20×PBS混合而成的。如实施例1所述，将混合物涂在预封闭的偶联缓冲液垫片上。
测试是这样进行的将测试盒置于实验室长台上，然后将40微升图9所示的II型疱疹阳性或阴性样品，通过样本盒的加样孔而加至样品垫片。当样品液体前沿达到末端样品流动区时，将包含了测试片的测试盒置于的ReLIATM仪上，该仪器已被设置好可运行检测抗II型疱疹抗体的ReLIATM分析并读取数据。之后，将125微升偶联缓冲液(PBS，10mg/ml BSA、0.1％叠氮化钠和2mM EDTA)加至测试盒的偶联缓冲液添加孔。测试片温度被设为40℃，并在10分钟后对测试片进行读数。样品的相对强度(RI)是根据一算法而计算出的，在该算法中将低对照反应(反射强度)的RI定为1，而将高对照反应(反射强度)的RI定为3，而零反应的RI定为0。
如图9所示，所有的II型疱疹阳性样品的相对强度值(RI)为0.58或更高，而所有的II型疱疹阴性样品的RI为0.01或更低。这表明在该测试中阳性和阴性群体可很好地被区分开。
4.幽门螺旋菌(Helicobacter pylori)的测试用于该实施例的测试片在高对照条带涂有800微克/毫升的兔抗-二硝基苯酚(抗-DNP)，在低对照条带涂有200微克/毫升的兔抗-二硝基苯酚(抗-DNP)，并且在抗原条带涂有Helicobacter pylori抗原(在280纳米处的光密度约为1.157)。这些条带在测试片上的次序是，抗原条带最接近偶联缓冲液垫片，低对照区位于抗原条带和高对照区之间，而高对照区离偶联缓冲液垫片最远且离吸收垫片最近。如实施例1所述，对硝酸纤维素片进行涂覆并制备测试片。
用A蛋白-OMNITM偶联物[A蛋白/BSA-DNP(2×/0.5×)]-8.5nm金，来涂覆预封闭的偶联缓冲液垫片，其中涂覆液的制备是通过将3份体积的偶联物原液(OD520约为63)与1份体积的PBS(含40毫克/毫升BSA、4％(w/v)Triton X-100，10％(w/v)蔗糖和1.2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K-30)和0.15份体积的20×PBS混合而成的。如实施例1所述，将混合物涂在预封闭的偶联缓冲液垫片上。
测试是这样进行的将测试盒置于实验室长台上，然后将40微升图10所示的Helicobacter pylori阳性或阴性样品，通过样本盒的加样孔而加至样品垫片。当样品液体前沿达到末端样品流动区时，将包含了测试片的测试盒置于的ReLIATM仪上，该仪器已被设置好可运行检测抗Helicobacter pylori抗体的ReLIATM分析并读取数据。之后，将125微升偶联缓冲液(PBS，10mg/ml BSA、0.1％叠氮化钠和2mM EDTA)加至测试盒的偶联缓冲液添加孔。测试片温度被设为40℃，并在10分钟后对测试片进行读数。样品的相对强度(RI)是根据一算法而计算出的，在该算法中将低对照反应(反射强度)的RI定为1，而将高对照反应(反射强度)的RI定为3，而零反应的RI定为0。
如图10所示，所有的Helicobacter pylori阳性样品的相对强度值(RI)为1.64或更高，而所有的Helicobacter pylori阴性样品的RI为1.14或更低。这表明在该测试中阳性和阴性群体可很好地被区分开。
对于本领域的技术人员而言，很明显可以在不背离本发明精神和范围的情况下，对本发明的装置和方法作各种改动和修改。因此，本发明覆盖了本发明的这些改动形式，只要它们在所附权利要求或等价形式的范围内。此外，下列实施例是为了阐明提出要求保护的本发明，而不是用于限制要求保护的本发明的范围。
权利要求
1.一种测试片，它适于接受样品并检测其中的分析物，其特征在于，该测试片包括可加入样品的加样区；位于加样区近端的吸收区；一个或多个位于加样区远端的测试区，其中至少一个测试区包含固定化的第一分析物结合剂，该结合剂能够结合于待检测的分析物；和位于一个或多个测试区远端的末端样品流动区，吸收区的位置与加样区相对而且吸收区相对测试片的其他区域而言具有吸收能力，从而使得加至加样区的样品远端扩散前沿从加样区扩散至末端样品流动区中的远端扩散点，然后逆转方向并扩散至相对于一个或多个测试区的近端。
2.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，该测试片适于接受预定体积范围约为10-250微升的样品。
3.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，该测试片适于接受预定体积范围约为20-100微升的样品。
4.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，该测试片适于接受预定体积范围约为30-50微升的样品。
5.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，末端样品流动区从近端至远端的长度约为3-10毫米。
6.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，第一分析物结合剂除了结合于分析物之外，并不结合于样品中的其他组份。
7.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，第一分析物结合剂选自下组抗体、工程化蛋白、肽、半抗原、含具有分析物结合位点的抗原的异源混合物的裂解物、配体和受体。
8.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，测试区还含有至少一个对照区，在对照区中固定有对照结合剂。
9.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，测试区还含有第一对照区，在第一对照区中固定有对照结合剂，和第二对照区，在第二对照区中固定有与第一对照区相同的对照结合剂，而第一对照区和第二对照区中对照结合剂的含量不同。
10.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，测试片还包括位于末端样品流动区远端的、含有第二分析物结合剂的区域，该第二分析物结合剂能够结合于分析物并能扩散至一个或多个测试区。
11.如权利要求10所述的测试片，其特征在于，第二分析物结合剂能够结合于样品中除分析物之外的组份。
12.如权利要求10所述的测试片，其特征在于，第二分析物结合剂并不与样品中除分析物之外的组份结合。
13.如权利要求10所述的测试片，其特征在于，第二分析物结合剂被可检测标记物所标记。
14.如权利要求10所述的测试片，其特征在于，第二分析物结合剂被附着于能够扩散至一个或多个测试区的颗粒上。
15.一种测试片，它适于接受预定体积范围的样品并检测其中的分析物，其特征在于，该测试片包括可加入样品的加样区；位于加样区近端的吸收区；一个或多个位于加样区远端的测试区，其中至少一个测试区包含固定化的第一分析物结合剂，该结合剂能够结合于待检测的分析物；位于一个或多个测试区远端的末端样品流动区，吸收区的位置与加样区相对而且吸收区相对测试片的其他区域而言具有吸收能力，从而使得按预定体积范围加至加样区的样品的远端扩散前沿，从加样区扩散至末端样品流动区中的远端扩散点，然后扩散至相对于一个或多个测试区的近端；和可加入偶联缓冲液的、位于末端样品流动区远端的偶联缓冲液添加区。
16.如权利要求15所述的测试片，其特征在于，该测试片适于接受预定体积范围约为10-250微升的样品。
17.如权利要求15所述的测试片，其特征在于，该测试片适于接受预定体积范围约为20-100微升的样品。
18.如权利要求15所述的测试片，其特征在于，该测试片适于接受预定体积范围约为30-50微升的样品。
19.如权利要求15所述的测试片，其特征在于，末端样品流动区从近端至远端的长度约为3-10毫米。
20.如权利要求15所述的测试片，其特征在于，第一分析物结合剂除了结合于分析物之外，并不结合于样品中的其他组份。
21.如权利要求15所述的测试片，其特征在于，第一分析物结合剂选自下组抗体、工程化蛋白、肽、半抗原、含具有分析物结合位点的抗原的异源混合物的裂解物、配体和受体。
22.如权利要求15所述的测试片，其特征在于，测试区还含有至少一个对照区，在对照区中固定有对照结合剂。
23.如权利要求15所述的测试片，其特征在于，测试区还含有第一对照区，在第一对照区中固定有对照结合剂，和第二对照区，在第二对照区中固定有与第一对照区相同的对照结合剂，而第一对照区和第二对照区中对照结合剂的含量不同。
24.如权利要求15所述的测试片，其特征在于，测试片还包括位于末端样品流动区远端的、含有第二分析物结合剂的区域，该第二分析物结合剂能够结合于分析物并能扩散至一个或多个测试区。
25.如权利要求24所述的测试片，其特征在于，第二分析物结合剂能够结合于样品中除分析物之外的组份。
26.如权利要求24所述的测试片，其特征在于，第二分析物结合剂并不与样品中除分析物之外的组份结合。
27.如权利要求24所述的测试片，其特征在于，第二分析物结合剂被可检测标记物所标记。
28.如权利要求24所述的测试片，其特征在于，第二分析物结合剂被附着于能够扩散至一个或多个测试区的颗粒上。
29.如权利要求24所述的测试片，其特征在于，含有第二分析物结合剂的区域位于偶联缓冲液添加区的近端。
30.如权利要求24所述的测试片，其特征在于，含有第二分析物结合剂的区域是偶联缓冲液添加区。
31.权利要求15所述的测试片，其特征在于，偶联缓冲液添加区的位置与测试区相对，从而使得在将样品加至加样区的同时被加至偶联缓冲液添加区的偶联缓冲液，会在样品远端扩散前沿已扩散至远端扩散点并已开始向近端方向扩散之后，才达到远端扩散点。
32.如权利要求15所述的方法，其特征在于，偶联缓冲液添加区的位置与测试区相对，从而使得在将样品加至加样区的同时被加至偶联缓冲液添加区的偶联缓冲液，会在样品远端扩散前沿相对于测试区向近端扩散之后，才达到测试区。
33.一种检测样品中分析物的方法，其特征在于，它包括将样品输送至测试片，使得样品远端扩散前沿(a)向远端方向扩散至一个或多个测试区，其中至少一个测试区含有固定于其中的第一分析物结合剂，该第一分析物结合剂与样品中的分析物结合，(b)扩散至位于一个或多个测试区远端的末端样品流动区，和(c)扩散至位于一个或多个测试区近端的位置；将偶联缓冲液输送至测试片上位于末端样品流动区远端的位置，输送偶联缓冲液导致第二分析物结合剂向近端扩散通过末端样品流动区，并且在样品远端扩散前沿向一个或多个测试区的近端扩散之后扩散至一个或多个测试区，第二分析物结合剂与被固定于测试区的分析物结合；和检测被固定于测试区的第二分析物结合剂。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，偶联缓冲液是在将样品加至测试片的同时被加至测试片上的。
35.如权利要求33所述的方法，其特征在于，偶联缓冲液是在将样品加至测试片之前被加至测试片上的。
36.如权利要求33所述的方法，其特征在于，偶联缓冲液是在将样品加至测试片之后被加至测试片上的。
37.如权利要求33所述的方法，其特征在于，第一分析物结合剂除了与分析物结合之外，并不结合于样品的其他组份。
38.如权利要求33所述的方法，其特征在于，第一分析物结合剂选自下组抗体、工程化蛋白、肽、半抗原、含具有分析物结合位点的抗原的异源混合物的裂解物、配体和受体。
39.如权利要求33所述的方法，其特征在于，第二分析物结合剂被包含在测试片上输送偶联缓冲液的区域，而输送偶联缓冲液会导致第二分析物结合剂的扩散。
40.如权利要求33所述的方法，其特征在于，第二分析物结合剂被包含在测试片上并位于输送偶联缓冲液区域的近端，而且输送偶联缓冲液会导致第二分析物结合剂的扩散。
41.如权利要求33所述的方法，其特征在于，将偶联缓冲液输送至测试片包括将包含在偶联缓冲液中的第二分析物结合剂输送至测试片。
42.如权利要求33所述的方法，其特征在于，测试区可包含其中固定有对照结合剂的第一对照区，输送偶联缓冲液导致对照剂向近端扩散通过末端样品流动区而达到第一对照区，并且结合于其中所固定的对照结合剂。
43.如权利要求33所述的方法，其特征在于，测试区包含第一和第二对照区并且各对照区含有不同数量的被固定的对照结合剂，输送偶联缓冲液导致对照剂向近端扩散通过末端样品流动区而达到第一和第二对照区，并且结合于其中所固定的对照结合剂。
44.如权利要求33所述的方法，其特征在于，第二分析物结合剂能结合于样品中除分析物之外的组份。
45.如权利要求33所述的方法，其特征在于，第二分析物结合剂不结合于样品中除分析物之外的组份。
46.如权利要求33所述的方法，其特征在于，第二分析物结合剂被可检测标记物所标记，而检测第二分析物结合剂包括检测可检测标记物。
47.如权利要求33所述的方法，其特征在于，第二分析物结合剂被附着于颗粒，检测第二分析物结合剂包括检测该颗粒。
全文摘要
提供了一种适于接受样品并检测其中分析物的测试片。该测试片包括:加入样品的加样区;位于加样区近端的吸收区;一个或多个位于加样区远端的测试区,其中至少一个测试区包含固定化的、能够结合于待检测的分析物的第一分析物结合剂;和位于一个或多个测试区远端的末端样品流动区,吸收区的位置与加样区相对且相对测试片的其他区域而言具有吸收能力,从而使得加至加样区的样品远端扩散前沿从加样区扩散至末端样品流动区中的远端扩散点,再逆转方向并扩散至一个或多个测试区的近端。
文档编号G01N33/543GK1277357SQ9912614
公开日2000年12月20日 申请日期1999年12月10日 优先权日1999年6月14日
发明者R·M·塞耶, A·J·波利托, R·K·德尼罗, G·H·谢拉, H·J·威克 申请人:普莱克斯生物系统股份有限公司