在自动染色仪上除去生物学标本包埋介质并调节细胞状态的制作方法

专利名称：在自动染色仪上除去生物学标本包埋介质并调节细胞状态的制作方法
涉及的有关申请本项申请要求以下申请的优先权于1998年9月3日提交的美国临时专利申请第60/099,018号，名为自动免疫组化仪器上从组织标本中除去包埋介质并调节细胞及组织的状态(在此引入作为参考)。
本项申请还要求以下申请的优先权于1999年2月26日提交的美国专利申请序号第09/259,240号，名为具有独立切片加热器的自动分子病理学器械(在此引入作为参考)。本项申请还要求以下申请的优先权于1999年2月26日提交的PCT专利申请第PCT/US99/04181号，名为具有独立切片加热器的自动分子病理学器械(在此引入作为参考)。
背景技术：
相关领域简述过去几年中根据患病器官上取材的组织或细胞标本的分析结果诊断的疾病急剧增多，除了传统的组织学染色技术和免疫组化鉴定，原位技术如原位杂交和原位聚合酶链式反应现均已用于辅助诊断人类疾病状态。因此，有多种技术不仅可以评定细胞形态，而且可以评定细胞内或组织内特殊大分子的存在。这些技术的每一项都需要制备样品细胞或组织，它可能包括用化学药品，如醛(例如甲醛，戊二醛)，福尔马林代替物，醇类(例如乙醇，甲醇，异丙醇)来固定标本或把标本包埋于惰性物质中例如石蜡，火棉胶，琼脂，聚合物，树脂，致冷介质或各种塑料包埋介质(例如环氧树脂和丙烯酸类树脂)。其他样品组织或细胞制剂需要物理处理例如冷冻(冰冻组织切片)或通过细针头抽吸(细针针吸活检(FNA))。不考虑组织或细胞标本或其制备、保存方法，技术专家的目的是获得准确的清楚的可重复的结果其允许对数据的精确解释。提供准确的、清楚的可重复的数据的一种方法是以一种方式制备组织或细胞，它使不管实验运用何种技术都可以使实验结果尽可能优化。这在免疫组化和原位技术情况下意味着增加了从特异探针(抗体，DNA,RNA)获取的信号数量。在免疫组化染色情况下它意味着增加了染色的强度或增加了染色的对比度。
不经防腐，组织标本迅速变质因此它们从主体脱离后不久在诊断学上的应用性即降低。1893年，Ferdinand Blum发现甲醛可用于保存或固定组织以使这种组织可用于组织化学过程。甲醛在固定组织中发挥作用的确切机制未完全确定，但它们参予同一蛋白内和不同蛋白之间的反应位点经亚甲桥的交联(Fox等，组织化学和细胞化学杂志，33:845-853(1985))。最近证据表明钙离子也起了作用(Morgan等，症理学杂志174:301-307(1994))。这些键连接引起蛋白质的四级和三级结构改变，但初级和二级结构看来被保留(Mason等，组织化学和细胞化学杂志，39:225-229(1991))。交联反应发生的程度依赖于多种条件诸如福尔马林的浓度，pH值，温度和固定的长度(Fox等，组织化学和细胞化学杂志33:845-853(1985))。一些抗原，例如胃泌素，生长激素抑制因子，2-1-抗胰蛋白酶，在福尔马林固定后可被检测出，但对于多数抗原，例如中间体丝和白细胞标志，免疫检测在福尔马林处理后失败或明显减少(McNicol和Richmond，组织病理学32:97-103(1998))。抗原免疫反应性的丧失在不连续的抗原决定簇，即形成抗原决定簇依靠的蛋白质序列中非邻近部分交汇点的氨基酸序列最明显。
抗原修复TM指使结构变化复原的努力，所述结构变化是用交联剂处理组织诱导的组织内抗原存在部位的结构改变。尽管有几种理论试图描述抗原修复TM的机制，例如解开或破坏由福尔马林固定形成的交联，但已很清楚，由福尔马林引起的蛋白质结构的改变在一些条件下如高温加热时是可逆转的。已清楚有几种因素影响抗原修复TM加热，pH值，溶液的摩尔浓度和溶液中的金属离子(Shi等，组织化学和细胞化学杂志45:327-343(1997))。
对福尔马林固定所掩盖的抗原的恢复，微波加热呈现为最重要的因素。微波加热(100°±5℃)在抗原修复TM免疫组化(AR-IHC)中通常产生较好结果。
用于在IHC中抗原修复的不同加热方法已有报道例如高压蒸汽法(Pons等，应用免疫组织化学，3:265-267(1995)；Bankfalvi等，病理学杂志，174:223-228(1994))，加压蒸气速煮(Miller和Estran，应用免疫组织化学，3:190-193(1995)；Norton等，病理学杂志，173:371-379(1994))；水浴(Kawai等，Path.Int.44:759-764(1994))，微波加塑性加压蒸气速煮(美国专利号；Taylor等(1995)；Pertschuk等，细胞生物化学杂志，19(增刊)134-137(1994))，和蒸汽加热(Pasha等，实验研究(Lab.Invest.)72:167A(1995)；Taylor等，CAP Today 9:16-22(1995))。
尽管在蒸馏水中进行微波加热时一些抗原产生满意的结果，但多数抗原在加热过程中需要应用缓冲液。某些抗原具有特殊的pH值要求例如仅在很小的pH值范围内才能得到满足要求的结果。目前，多数抗原修复TM溶液在pH值大约6-8时使用，但某些指征表明略微偏碱的溶液可以提供一定程度上略好的结果(Shi等，组织化学和细胞化学杂志，45:327-343,(1997))。
尽管包括金属离子在内的抗原修复TM溶液的化学成分可能在微波过程中作为可能的辅助因子起作用，至今，尚未鉴定出对抗原修复TM既是必需的又是最好的一种化学药品。
许多溶液和方法常规用于增强染色。它们可能包括但不局限于以下这些蒸馏水，EDTA，尿素，Tris，甘氨酸，生理盐水和柠檬酸盐缓冲液。包含各种去污剂(离子的或非离子表面活性剂)的溶液可能也能在很宽的温度范围(从室温到超过100℃)内促进染色增强。
除了可能存在于细胞外部的细胞表面分子，可在IHC,ISH和其他组织化学和细胞化学操作中检测的其他分子位于胞内，经常位于核膜上。这些分子中的一些在暴露于象福尔马林等固定液(促凝固的或促沉淀的)时会发生分子变形。因此就这些分子而言，不仅需要克服固定作用的影响而且需要增加细胞通透性以促进有机和无机化合物与细胞的相互作用。
其他组织标本在实验前可能未经受交联剂处理，但就这些组织而言改善结果也是重要的。有种种非福尔马林方法用于保存和制备细胞学和组织学标本。这些方法的实例包括但不局限于以下a)血液学涂片，CytospinsTM,ThinPrepsTM,touch preps，细胞系，淋巴细胞的Ficoll分离物和棕黄层等用许多方式常规保存，这些方式包括但不局限于风干，酒精固定，喷雾固定液和贮存于蔗糖/甘油等贮存基质中。b)将组织和细胞(固定的和未固定的)冷冻，随后进行各种稳定技术例如防腐，固定和干燥。c)组织和细胞可以稳定在非交联醛类固定剂，包含非醛类的固定剂，醇类固定剂，氧化剂，重金属固定剂，有机酸和转移介质中。
改善实验结果的一种方式是增强从指定标本上获得的信号。一般说来，增强的信号可通过使指定分子更易进入其靶目标而获得。对胞内发现的抗原而言，通过增加细胞通透性可以使胞内的靶目标变得更易接近，增加细胞通透性因而允许更多分子进入细胞，也因而增加分子发现它的靶目标的可能性。这种增强的通透性对诸如ISH，原位PCR,IHC，组织化学和细胞化学等技术尤其重要。
组织和细胞也要被包埋于多种惰性介质中(石蜡，火棉胶，OCTTM，琼脂，塑料或丙烯酸类树脂等等)以帮助保存它们用于将来分析。多数这些惰性物质是疏水的而用于组织学和细胞学的试剂主要是亲水的，因此在实验前需要从生物样品上除去惰性介质。例如，制备石蜡包埋组织切片用于随后的实验要从组织切片除去石蜡，除去石蜡靠将切片通过各种有机溶剂如甲苯，二甲苯，柠檬烯，或其他合适的溶剂。传统的脱蜡用有机溶剂，这一般需要在通风橱中进行。而且应用和消除这些溶剂增加了分析费用和相应于每份待检组织标本的暴露危险度。
目前，没有有效的技术通过自动方式直接加热切片以从样品组织上除去惰性介质。目前也不可能在一步自动染色处理中调节样品组织或细胞的状态从而除去样品组织上的惰性介质。
本项发明的方法能a)不用有机溶剂自动而去除包埋介质，因而使细胞易于染色，也因此减少时间、费用和安全风险，b)不需从样品细胞或组织上自动去除包埋介质即可自动调节细胞状态。c)多步骤自动过程即暴露细胞，调节细胞状态和增加细胞学或组织学样本通透性，因而增加标本清晰性和改善实验数据的分析结果。本项发明中的方法可应用于在细胞学和组织学染色技术中使用的大多数组织学和细胞学标本的可染色性和清晰性。
发明简述本发明涉及一种不需有机溶剂而除去包埋介质的自动方法，该方法用于暴露组织学或细胞学检验过程中所用的生物学标本。
本发明进一步涉及一种调节细胞状态的自动方法，细胞状态的调节改善了生物学标本中分子的可进入性。
本发明还涉及一种自动方法，该方法用于使生物标本暴露并同时调节细胞状态以便用于组织化学和细胞化学应用。
优选实施方案的详细说明本项发明的一个实施方案涉及通过除去惰性物质而暴露生物学标本，其中生物学标本已为防腐和支持而包埋于此惰性物质中。在本发明的一个优选实施方案中，石蜡或其他惰性物质从生物学标本上的去除通过加热生物学标本的一侧而实现。此种方法可通过接触加热已放置了包埋的生物学标本的显微镜载玻片来完成。其他能从包埋的生物学标本上除去的惰性物质包括但不局限于琼脂和致冷的介质。这种除去惰性包埋介质或浸蚀包埋介质的过程在此称作暴露。
在本发明的一个优选方法中，置于玻璃载玻片上的石蜡包埋的生物学标本首先由一加热元件加热。加热元件在自动染色仪器(1997年12月19日提交的美国专利申请序号08/995,052和1998年2月27日提交的美国临时专利申请序号60/076,198，两者在此引入作为参考)上将热量暴露于生物学标本的一面(例如美国专利申请09/259,240号公开的热平台，在此引入作为参考)使标本片烘干且石蜡熔化。通常，生物学标本放置于载玻片(如玻璃载玻片)的上表面上，然后将载玻片放于热平台上面，因此载玻片的下表面与热平台接触。热平台经传导加热载玻片的下面部分。加热生物学标本之后，惰性物质可被流质(气体或液体形式)从载玻片上除去。例如，惰性物质可以用去离子(DI)水或表面活性剂冲洗掉。
在本发明的另一方法中，石蜡包埋的生物学标本放于玻璃的显微镜载玻片上，且显微镜载玻片放于加热元件上。将一种试剂加于生物学标本载玻片上，然后使生物学标本载玻片升温，这将使惰性物质融化，此后惰性物质可被流质(气体或液体形式)从载玻片上除去。
在本发明的一个优选实施方案中，加热包埋的生物学标本的同时使用试剂。适宜的试剂可包括但不局限于以下这些，去离子水，柠檬酸盐缓冲液(pH6.0-8.0)，Tris-盐酸缓冲液(pH6-10)，磷酸盐缓冲液(pH6.0-8.0)，SSC缓冲液，APK WashTM，酸性缓冲液或溶液(pH1-6.9)，碱性缓冲液或溶液(pH7.1-14)，矿物油，Norpar,Canola油，和PAG油。这些试剂的每一种都可能也包含离子或非离子表面活性剂例如Triton X-100，吐温，Brij，皂素和十二烷基硫酸钠。
在本发明的一个方法中，加热元件的温度升高到超过惰性物质熔点的温度。例如，在Merck目录中列出的纯石蜡的熔点为50-57℃，因此，在本发明的方法中，温度为超过有生物学标本包埋于其中的石蜡的熔点。在本发明的优选方法中，温度升高至50℃以上到大约130℃。
在本发明的一个方法中，熔化惰性物质所需的持续时间将按照所用的温度和包埋物质的不同而不同。通常，在自动系统中，处理器，例如微处理器，连同存储器一同使用。熔化石蜡所需时间和温度值包含于存储器中存有的表格内。
包埋生物学标本的石蜡经受高温处理5分钟至60分钟。本发明的方法中所用的加热元件要求放有生物学标本的表面与加热元件之间维持充分的接触。
本发明的另一优选实施方案涉及无需去除惰性物质而暴露生物学标本，其中生物学标本为防腐和支持已包埋于此惰性物质中。在本发明的优选实施方案中，通过接触加热其上包埋有生物学标本的显微镜载玻片而使生物学标本做好实验准备。其他不从包埋的生物学标本上除去的惰性物质包括但不局限于塑料或火棉胶包埋介质和/或其他聚合物和树脂。
在本发明的一个优选实施方案中，置于玻璃载玻片上的包埋的生物学标本首先由加热元件加热。该加热元件在该生物学标本的一侧加热，如通过在自动染色仪器(美国专利申请08/995,052号和60/076,198号)上应用美国专利申请09/259,240号所公开的热平台使标本片干燥。
在本发明的另一优选方法中，包埋的生物学标本放置于玻璃显微镜载玻片上且显微镜载玻片的一面被加热(如，通过把载玻片放于热平台上)。然后在生物学标本载玻片上放试剂，然后将生物标本载玻片和试剂一起再加热至特定温度(范围从室温到超过100℃)且加热指定的时间长度(范围从2分钟到12小时)。这会引起惰性包埋物质表面的浸蚀，此后浸蚀试剂靠流质(作为气体或液体)从载玻片上去除。如前面所讨论的，时间长度和指定温度可以贮存于存储器中。
在本发明的优选方法中，使用试剂的同时加热或不加热包埋的生物学标本。适宜的试剂可能包括，但不局限于下列，去离子水，柠檬酸盐缓冲液(pH6.0-8.0)，Tris-盐酸缓冲液(pH6-10)，磷酸盐缓冲液(pH6.0-8.0)，SSC缓冲液，APK WashTM，酸性缓冲液或溶液(pH1-6.9)，碱性缓冲液或溶液(pH7.1-14)，矿物油，Norpar,Canola油，和PAG油。这些试剂的每种中可能也包含离子或非离子表面活性剂诸如Triton X-100，吐温，Brij，皂素和十二烷基硫酸钠。
在本发明的方法中，加热元件的温度设定为适于干燥或浸蚀包埋的生物学标本的水平。例如，在从室温到37℃的范围内用碱性甲醇氢氧化钠溶液(甲醇钠)可以完成浸蚀。
在本发明的方法中，浸蚀惰性物质所需的持续时间根据所用温度和包埋物质(塑料或火棉胶包埋介质和/或其他聚合物和树脂等等)不同而不同。在本发明的一个优选方法中包埋的生物学标本接受范围从2分钟到12小时的适宜温度。本发明方法中所用加热元件要求放置了生物学标本的表面与加热元件之间维持充分接触。
本发明的一个优选实施方案也包括调节细胞状态的自动方法，它在从生物学标本上去除或浸蚀惰性包埋物质的同时，随后或单独进行。现已发现在适宜的(有机的或无机的)试剂中加热生物学标本可改善试剂对细胞内靶分子(蛋白质，核酸，糖类，脂类，色素或其他小分子)的易接近性。改善试剂(有机的或无机的)对靶分子易接近性的方法在此称作调节细胞状态。
在本发明的一个方法中，调节细胞状态在如上面所述暴露生物学标本的同时完成。在本发明的这个方法中，生物学标本放于玻璃的显微镜载玻片上且显微镜载玻片在一自动染色仪器(美国专利申请08/995,052和60/076,198)上加热其一面(如，通过将载玻片放于热平台上)。将一种试剂加于生物学标本上且加热元件的温度可以升高也可不升高。生物学标本于适宜的温度暴露适宜时间这将使惰性物质熔化或浸蚀而且调节细胞状态使生物标本随后用组织学或细胞学技术染色。
用于调节细胞状态的试剂可以和用于暴露包埋的生物学标本的试剂相同。例如，以DNA为靶目标，调节细胞状态的溶液可以是EDTA溶液；常规温度可以设为95℃持续6-60分钟。以蛋白质为靶目标，调节细胞状态的溶液可以用硼酸缓冲液，常规温度可以设为超过100℃持续6-60分钟。以RNA为靶目标，调节细胞状态的溶液可以用SSC溶液，常规温度可设置为75℃持续6-60分钟。用于组织化学反应，例如苏木精和伊红(HE)染色，调节细胞状态的溶液可以是去离子水；常规的温度可以为60-80℃持续6-30分钟。在Gu编的Eaton Publishing公司(1997)出版的Analytical Morphology的1-40页列出了部分可用的试剂。通常应该知道溶液的摩尔浓度，pH值，和成分。最好在调节溶液中加入十二烷基硫酸钠(SDS)，乙二醇。此外，可以向这些试剂中加入金属离子或其他物质以增强调节细胞状态的效果。
在本发明的另一方法中，调节细胞状态在如上所述暴露生物学标本的随后完成。在本发明的这个方法中生物学标本放于玻璃的显微镜载玻片上而且显微镜载玻片在自动染色仪器上(美国专利申请08/995,052和60/076,198)加热其一面(例如，通过把载玻片放于热平台上)。在此方法中，放于玻璃载玻片上的包埋的生物学标本首先要在自动染色仪器的加热元件上加热，使标本片被烘干而且通过应用流质可熔化或浸蚀并去除包埋物质。暴露生物学标本之后，应用适合的试剂以调节细胞状态使生物标本随后用组织学或细胞学技术染色。
用于调节细胞状态的试剂可以和用于暴露包埋的生物学标本的试剂相同。例如，以DNA为靶目标，调节细胞状态的溶液可以用SSC溶液；通常温度可设置为95℃持续6-60分钟。以蛋白质为靶目标，调节细胞状态的溶液可以是磷酸盐缓冲液，通常温度可设为超过100℃，持续6-60分钟。以RNA为靶目标，调节细胞状态的溶液可以是SSC溶液，通常温度可设置为75℃，持续6-60分钟。用于组织化学反应，例如Trichrome染色，调节细胞状态的溶液可以用Bouins；通常温度范围可以为60-80℃，持续6-30分钟。
然而在本发明的另一方法中，调节细胞状态的完成不需暴露生物学标本。在本发明的这种方法中，生物学标本放于玻璃的显微镜载玻片上且显微镜载玻片放于自动染色仪器的加热元件上。将试剂加于生物学标本上，加热元件的温度可升高或不升高。生物学标本的细胞状态调节可在用组织学或细胞学技术染色之前进行。
用于调节细胞状态的试剂可以和用于暴露包埋的生物学标本的试剂相同。例如，以DNA为靶目标，调节细胞状态的溶液可以是柠檬酸钠溶液。通常温度可设为90℃，持续时间6-60分钟。以蛋白质为靶目标，调节细胞状态的溶液可以是尿素溶液，通常温度可设为超过100℃，持续6-60分钟。对于整个细胞，调节细胞状态的溶液可以是甲醇溶液，通常温度可设为室温，持续4-10分钟。用于组织化学反应，例如抗酸杆菌(AFB)染色时，调节细胞状态的溶液可以是花生油，通常温度范围60-70℃，持续30-60分钟。
本项发明还包括对细胞学标本的细胞状态调节，所述细胞学标本如细针针吸活检(FNA)涂片，touch preps,Ficoll,Cytospins,Thins Preps，官颈-阴道巴氏涂片，血液或体液膜(film)，等等，它们既不用醛类固定也不用包埋于象石蜡这样的基质中。许多是在醇类，如甲醇或乙醇中固定，其他用吹风机或其他气雾固定液喷雾和干燥，还有一些被置于细胞学固定液中，此固定液可于其他成分中包括碳蜡和Saccomanno’s(有机或无机的)试剂。细胞经离心或过滤后加于载玻片上或者直接接触粘附(touch)于玻璃载玻片上，在某些情况下涂片(巴氏)或直接应用于载玻片上(touch preps)。
术语“生物学标本”意思是可被封片于标准显微镜玻璃载玻片上的任何细胞标本(分开的或组织中的)，它们包括，但不局限于以下器官切片，肿瘤切片，体液，涂片，冰冻切片，血液，细胞学标本，微生物和细胞系。
术语“染料”意思是生物的或化学的实体，当将其应用于生物学标本中的靶分子时，可使分子在显微镜下成为可观察的。染料包括但不局限于以下可探测的核酸探针，抗体，以及联合或独自导致发色的终产物(明亮区或荧光)的其他试剂。
以下提供的实施例仅用作说明目的，而且在任何情况下它们既未被打算也不应被解释为限定本发明的限度。本领域技术人员会发现在不超出本发明的精神和范围时下面的一些变化可以实行。所有专利，专利申请和其他发表物在此以其整体引入以作参考。
实施例实施例1用于HE染色的生物学标本的自动暴露和细胞状态调节已包埋于石蜡中的包括乳腺CHTN 33，胃149G，脑，扁桃体和肾的生物学标本按照以下方案暴露将包含以上提及的生物学标本的载玻片放置于自动仪器上(Ventana Medical Systems,Inc.,Tucson,AZ)按下述的暴露方案进行暴露。一般地，包含石蜡包埋的生物学标本的载玻片被烘干加热至65℃保持6分钟，然后用1X柠檬酸盐缓冲液、去离子水，10mM磷酸盐缓冲液(pH=6.3)，或10mM Tris-盐酸缓冲液(pH=7.4)冲洗，以上每种液体包含有0.1％Triton X-100。
暴露方案11．保温2分钟2．冲洗切片
3．调整切片容量并使用液体盖玻片CoverslipTM4．保温6分钟5．冲洗切片6．调整切片容量并使用液体盖玻片CoverslipTM7．升温至65.0℃8．冲洗切片9．调整切片容量并使用液体盖玻片CoverslipTM10．保温4分钟11．调整切片容量并使用液体盖玻片CoverslipTM12．保温4分钟13．调整切片容量并使用液体盖玻片CoverslipTM14．保温4分钟15．冲洗切片16．降温至42.0℃17．调整切片容量并使用液体盖玻片CoverslipTM18．保温4分钟19．冲洗切片20．降温至42.0℃21．调整切片容量并使用液体盖玻片CoverslipTM22．保温4分钟23．冲洗切片自动暴露后，生物学标本按以下方法用苏木精和伊红染色。切片放于苏木精1中(Richard Allen Scientific,Kalamazoo,MI)保持1.5分钟，然后用去离子水流水冲洗1分钟。切片然后放于酸性酒精澄清器(Richard AllenScientific)中保持1分钟，之后用去离子水流水冲洗1分钟。随后将切片置于稀释的氨-蓝试剂中1分钟(Richard Allen Scientific,Kalamazoo,MI)，接着用去离子水流水冲洗1分钟。继之将切片于95％乙醇中冲洗后置于2.5％伊红Y(Richard Allen Scientific,Kalamazoo,MI)中2.5分钟。切片上的生物学标本通过浸泡于100％乙醇溶液中1分钟使其脱水。该过程重复三次，然后生物学标本于二甲苯中浸浴3分钟，重复2次。脱水步骤完成后生物学标本用盖玻片封片。
对照的生物学标本用传统的以溶剂为基础的脱蜡技术脱蜡。将置于显微镜载玻片上且在石蜡中保存的生物学标本完全浸入二甲苯中5分钟。包含生物学标本的切片浸入第二份二甲苯中5分钟。在从第二份二甲苯中取出后，将切片置于100％乙醇液中浸泡3分钟。随后再次将切片置于第二份100％乙醇液中3分钟，然后置于90％乙醇溶液2分钟。将切片置于80％乙醇中1分钟，然后完全浸没于蒸馏水中1-3分钟。脱蜡后，生物学标本用上面叙述的苏木精-伊红染色。
经溶剂技术脱蜡的生物学标本和经自动加热技术脱蜡的标本在苏木精-伊红染色后进行对比。各组切片的形态学都是合格的且基本相同。用自动加热方法暴露的扁桃体和脑的生物学标本比用标准溶剂技术脱蜡的生物学标本显示出更强的苏木精染色。
实施例2自动暴露生物学标本同时调节细胞状态已用福尔马林固定且包埋于石蜡中的肾脏Q-10和扁桃体T998D生物学标本按照实施例1中描述的方案进行暴露。自动暴露后，将生物学标本用免疫组化染色用的DAB石蜡方案处理。DAB染色的方案描述如下1．保温2分钟2．冲洗切片3．调整切片容量并使用液体盖玻片CoverslipTM4．冲洗切片5．调整切片容量并使用液体盖玻片CoverslipTM6．冲洗切片7．调整切片容量并使用液体盖玻片CoverslipTM8．加上一滴抑制剂9．保温4分钟10．调整切片容量并使用液体盖玻片CoverslipTM11．加上一滴第一抗体12．保温32分钟13．调整切片容量并加上液体盖玻片CoverslipTM14．加上一滴生物素化的免疫球蛋白15．保温8分钟
16．冲洗切片17．调整切片容量并加上液体盖玻片CoverslipTM18．加上一滴抗生物素蛋白-HRPO19．保温8分钟20．冲洗切片21．调整切片容量并加上液体盖玻片CoverslipTM22．加上一滴DAB和一滴DAB H2O223．保温8分钟24．冲洗切片25．调整切片容量并加上液体盖玻片TM26．加上一滴铜(Copper)27．保温4分钟28．冲洗切片用于肾Q-10生物学标本的第一抗体是抗-CD 15(Ventana Medical Systems,Inc.Tucson,AZ，目录第250-2504条)。用于扁桃体T998D生物学标本的第一抗体是抗CD 45RO(Ventuna Medianl Systems,Inc.Tucson,AZ，目录第250-2563条)。所用的DAB染色试剂盒买自Ventana Medical Systems,Inc.Tcson,AZ，目录第250-001条。
对照的生物学标本用实施例1中描述的溶剂为基础的传统脱蜡技术脱蜡。脱蜡后将生物学标本置于装有1.5L的1X柠檬酸盐缓冲液的压力锅中(型号#62104 Nordic Ware,Minneapolis,MN)。将压力锅密封然后置于微波炉中(型号#MQSO 836E,Matsushita,Franklin Park,IL)。将微波炉设置为“高”，标本受微波加热约30分钟。微波加热后标本在压力锅内“保存”30分钟，压力锅的盖要确保关牢固。经保存后将生物学标本置于1X柠檬酸盐缓冲液中2分钟。然后将生物学标本从柠檬酸盐缓冲液中取出，用吸水纸印在切片末端以去除多余的柠檬酸盐缓冲液。吸干多余水后，切片置于自动仪器上按上述方法进行免疫组化染色。
经溶剂技术脱蜡的生物学标本与经自动暴露并同时调节细胞状态技术处理的标本在免疫组化染色后进行对比。各组切片在形态学上都合格且基本相同。
两步自动“暴露”和“调节细胞状态”已保存于石蜡中且经甲醛处理的扁桃体T998D标本，扁桃体Ki67,E68,E7,E33,E8,E29,E15和E68标本按下面方案处理暴露和调节细胞状态1．保温2分钟2．升高热箔温度至65.0℃3．保温6分钟4．冲洗切片并加上盖玻片5．保温6分钟6．冲洗切片并加盖玻片7．升高热箔温度至100.0℃8．调整切片容量并加液体盖玻片CoverslipTM9．冲洗切片10．调整切片容量并加液体盖玻片CoverslipTM11．保温4分钟12．调整切片容量并加液体盖玻片CoverslipTM13．保温4分钟14．调整切片容量并加液体盖玻片CoverslipTM15．保温4分钟16．调整切片容量并加液体盖玻片CoverslipTM17．保温4分钟18．调整切片容量并加液体盖玻片CoverslipTM19．保温4分钟20．调整切片容量并加液体盖玻片CoverslipTM21．保温4分钟22．调整切片容量并加液体盖玻片CoverslipTM23．保温4分钟24．调整切片容量并加液体盖玻片CoverslipTM25．保温4分钟26．调整切片容量并加液体盖玻片CoverslipTM27．保温4分钟
28．冲洗切片29．降低温度至42.0℃30．调整切片容量并加液体盖玻片CoverslipTM31．保温4分钟32．冲洗切片33．降温至20.0℃34．调整切片容量并加液体盖玻片CoverslipTM35．保温4分钟36．冲洗切片方案中所用缓冲液为SSC缓冲液加有20％甲酰胺或0.1％Triton。生物学标本经受以上方案处理后，使用实施例2中用于免疫组化染色的DAB石蜡方案。扁桃体生物学标本用抗-Ki67作为第一抗体进行处理。样品E68,E7,E33和E8生物学标本用抗-雌激素受体(6F11)作为第一抗体进行处理。E29,E15和E68生物学标本用抗-孕酮受体(1A6)作第一抗体进行处理。
对照的生物学标本按实施例1中所述的溶剂为基础的传统脱蜡技术脱蜡。脱蜡后将生物学标本置于装有1.5L的1X柠檬酸盐缓冲液的压力锅中(型号#62104 Nordic Ware,Minneapolis,MN)。将压力锅密封然后置于微波炉中(型号#MQSO 836E,Matsushita,Franklin Park,IL)。将微波炉设置为“高”，标本受微波加热约30分钟。微波加热后标本在压力锅内“保存”30分钟，压力锅的盖要确保关牢固。经保存后将生物学标本置于1X柠檬酸盐缓冲液中2分钟。然后将生物学标本从柠檬酸盐缓冲液中取出，用吸水纸印在切片末端以去除多余的柠檬酸盐缓冲液。吸干多余水后，切片置于自动仪器上按上述方法进行免疫组化染色。
经溶剂技术脱蜡的生物学标本和经自动加热技术脱蜡的生物学标本在免疫组化染色后进行对比。各组切片的形态学是合格的且基本相同。
实施例4非石蜡包埋的原位细胞系的细胞状态自动调节(Thin Preps)贮存于Cytyk制备液(批号#01139Q)的Hela(批号#980427H),Caski(批号#980416C)和Siha(批号#980416S)细胞系用Cytyk 2000仪器沉积于显微镜载玻片上。沉积后将切片置于酒精中保湿直至在Discovery原位染色模具(Ventana Medical Systems Inc,Tucson,AZ)上使用。将切片装入仪器并用由20×SSC(Ventana P/N 650-012)配制的2×SSC湿润。将切片按调节细胞状态的方案进行处理，此方案目前指Depar 30，在此将切片用2×SSC冲洗并升温至95℃保持大约30分钟。然后切片被冷却至37℃，于进行原位染色前用APK Wash冲洗。
应用Blue Swap ISH方案将细胞系用HPV 16/18(Enzo HPV 16/18 BioProbe cat#32874)染色。使用探针之前将细胞系用蛋白酶2(Ventana P/N250-2019)酶解消化。使用探针后，探针和生物学标本同时于95℃保温8分钟以变性。在55℃用2×SSC严格洗脱以洗去非特异性结合的探针。然后用Streptaividin Alk Phos和NBT/BCIP检测探针。
染色后细胞系置于95％乙醇中1分钟和100％乙醇中1分钟，重复2次以脱水。过乙醇后切片暴露于二甲苯中3分钟，重复两次。脱水后将切片封片。
染色的细胞系经调节后显示满意的形态，在这些片子中有高背景说明该方法需要进一步完善。
加湿装载切片1．Skip Application并保温2分钟2．冲洗切片(2×SSC缓冲液)(加温切片至65℃)3．调整切片容量，然后加盖玻片4．SkipApplication并保温6分钟5．冲洗切片(2×SSC缓冲液)(加温切片至95℃)6．调整切片容量，然后加盖玻片7．冲洗切片8．调整切片容量，然后加盖玻片9．Skip Applicaiton并保温4分钟10．调整切片容量，然后加盖玻片11．Skip Applicaiton并保温4分钟12．调整切片容量，然后加盖玻片13．Skip Applicaiton并保温4分钟14．调整切片容量，然后加盖玻片15．Skip Applicaiton并保温4分钟16．调整切片容量，然后加盖玻片
17．Skip Applicaiton并保温4分钟18．调整切片容量，然后加盖玻片19．Skip Applicaiton并保温4分钟20．调整切片容量，然后加盖玻片21．Skip Applicaiton并保温4分钟22．冲洗切片(2×SSC缓冲液)(加温切片至37℃)23．调整切片容量，然后加盖玻片24．Skip Applicaiton并保温4分钟25．冲洗切片(APK Wash)26．调整切片容量，然后加盖玻片实施例5用于单拷贝DNA检测的自动“暴露”和“细胞状态调节”包含有福尔马林固定的，石蜡包埋的细胞系Caski(R96-1050A)和Siha(R96-96-C2)的切片在Ventana靶载玻片上染色。将切片干燥装于仪器上且将切片升温至65℃。按Depar 30方案进行，即将切片于65℃用2×SSC缓冲液冲洗，然后加热至95℃保持约40分钟。随后将切片冷却至37℃，用APK Wash冲洗。此时再按下面的原位方案进行原位方案Tubbs 1(在非探针步骤中用Dako TBST#3306代替Ventana APK Wash)蛋白酶消化蛋白酶2,4分钟，37℃抑制剂步骤DAB试剂盒中的Ventana抑制剂，32分钟，37℃探针 Enzo HPV Bio Probe 16/18对照探针Enzo HPV Bio Probe 6/11变性95℃，8分钟杂交37℃，64分钟60℃，2×SSC严格洗脱2次，每次8分钟第3次2×SSC严格洗脱，37℃，4分钟探针检测链抗生物素蛋白HRPO(Dako Gen Point # K0620)扩增生物素化的酪酰胺(Tyramide)(Dako GenPoint # K0620)检测链抗生物素蛋白HRPO(Dako Gen Point # K0620)或链抗生物素蛋白Alk Phos(Vector # SA 5100)
色原 DAB(Dako Gen Point # K0620)或 Ventana NBT/BCIP(Kit P/N)或 Ventana萘酚/坚牢红(Kit P/N)实施例6对非石蜡包埋标本的自动“细胞状态调节”实施例2中描述的DAB染色方案被用于本实施例。
用Cytyk 2000仪器制备细胞系的Thin Preps后，对这些抗体进行细胞状态的调节。在Ventana ES仪器，NexES仪器使用手动操作(Cytyk,Inc.)以抗ER,PgR,Ki67,P53的抗体对Thin Preps进行染色。切片的重复组已在NesES原位模具上染色，其中允许细胞状态调节步骤自动进行。
尽管上面所述实施例是特异针对Cytyk仪器和ThinPreps染色，但经验不局限于此种制备细胞标本的方式。
实施例7冰冻生物学标本的“细胞状态调节”从扁桃体297C和297D的每块冰冻组织切下6片以制备冰冻扁桃体标本，置于显微镜用载玻片上。选自每块组织的4张切片放于DiscoveryTM原位模具上实行Depar 10方案。
将切片加热至65℃保持6分钟烘干，然后用pH8的0.1M EDTA缓冲液冲洗。之后，切片于65℃保温20分钟。随后将切片冷却至37℃并用APK Wash冲洗。每块组织留出的两片切片不进行处理以作为对照。按Depar 10处理后，每块组织的两张处理过的切片和一张未处理的切片用实施例1中所述的方法HE染色。每块组织的另两张处理过的切片和一张未处理的切片做LCA染色。所得结果对HE染色和抗体染色在处理过的和未处理的切片间染色无差别。
从前面的详细描述，可以意识到在不背离本发明的真正精神和范围时，可对本发明做许多变化和修改。本发明的真正精神和范围由附加的权利要求书定义，权利要求书由前面的详细叙述解释。
权利要求
1．在生物学染色过程中从生物学标本上除去包埋介质的自动方法，此方法包括以下步骤在生物学标本上应用暴露试剂；对生物学标本进行加热；和使用流质除去暴露试剂。
2．根据权利要求1的自动方法，其中的生物学标本被放置于载玻片的上表面，其中对生物学标本进行加热的步骤包括使载玻片底面加热。
3．根据权利要求2的自动方法，其中载玻片的底面与热平台接触，其中使载玻片底面加热的步骤包括用热平台经传导加热载玻片。
4．根据权利要求1的自动方法，其中加热步骤包括加热生物学标本至室温至130℃的范围。
5．根据权利要求1的自动方法，其中加热步骤包括加热生物学标本至室温至100℃的范围。
6．根据权利要求1的自动方法，其中使用流质除去暴露试剂的步骤包括用冲洗介质冲洗切片。
7．根据权利要求6的自动方法，其中冲洗介质选自空气、去离子水、柠檬酸盐缓冲液(pH6.0-8.0)，Tris-盐酸缓冲液(pH6-10)，磷酸盐缓冲液(pH6.0-8.0)，SSC缓冲液，APK WashTM，酸性缓冲液或溶液(pH1-6.9)，碱性缓冲液或溶液(pH7.1-14)，矿物油，Norpar,Canola油，和PAG油。
8．根据权利要求6的自动方法，其中冲洗介质包括离子或非离子的表面活性剂。
9．根据权利要求8的自动方法，其中离子的或非离子的表面活性剂选自Triton X-100，吐温，Brij，十二烷基硫酸钠和皂素。
10．在生物学染色过程中从生物学标本上除去包埋介质的自动方法，此方法包括以下步骤加热生物学标本；和使用流质除去包埋介质。
11．根据权利要求10的自动方法，其中的生物学标本被放置于载玻片的上表面，其中对生物学标本进行加热的步骤包括使载玻片底面加热。
12．根据权利要求11的自动方法，其中载玻片的底面与热平台接触，其中使载玻片底面加热的步骤包括用热平台经传导加热载玻片。
13．根据权利要求10的自动方法，其中加热步骤包括加热生物学标本至室温至130℃的范围。
14．根据权利要求10的自动方法，其中加热步骤包括加热生物学标本至室温至100℃的范围。
15．根据权利要求10的自动方法，其中除去包埋介质的流质包括一种去污剂。
16．根据权利要求10的自动方法，进一步包括在加热生物学标本之前使用第二种流质的步骤。
17．根据权利要求16的自动方法，其中的第二种流质是去离子水。
18．在生物学染色过程中从生物学标本中浸蚀包埋介质的自动方法，此方法包括以下步骤使用至少一种浸蚀溶液；和使用流质除去这至少一种浸蚀溶液。
19．根据权利要求18的自动方法进一步包括，于使用至少一种浸蚀溶液后对生物学标本加热的步骤。
20．根据权利要求19的自动方法，其中加热的步骤包括加热生物学标本使温度达室温至100℃。
21．根据权利要求1的自动方法，其中使用流质除去至少一种浸蚀溶液的步骤包括用冲洗介质冲洗切片。
22．根据权利要求21的自动方法，其中冲洗介质选自空气，去离子水，柠檬酸盐缓冲液(pH6.0-8.0)，Tris-盐酸缓冲液(pH6-10)，磷酸盐缓冲液(pH6.0-8.0)，SSC缓冲液，APK WashTM，酸性缓冲液或溶液(pH1-6.9)，碱性缓冲液或溶液(pH7.1-14)，矿物油，Norpar,canola油，和PAG油。
23．根据权利要求21的自动方法，其中冲洗介质包括离子的或非离子的表面活性剂。
24．根据权利要求23的自动方法，其中离子的或非离子的表面活性剂选自Triton X-100，吐温，Brij，十二烷基硫酸钠和皂素。
25．在生物学染色过程中不需除去或浸蚀包埋介质而调节细胞状态的自动方法，此方法包括以下步骤对生物学标本加热；应用至少一种调节试剂；和应用流质除去此至少一种调节试剂。
26．根据权利要求25的自动方法，其中生物学标本被加热至室温至130℃。
27．根据权利要求25的自动方法，其中这至少一种调节试剂选自空气，去离子水，柠檬酸盐缓冲液(pH6.0-8.0)，Tris-盐酸缓冲液(pH6-10)，磷酸盐缓冲液(pH6.0-8.0)，SSC缓冲液，APK WashTM，酸性缓冲液或溶液(pH1-6.9)，碱性缓冲液或溶液(pH7.1-14)，矿物油，Norpar,canola油，和PAG油。
28．根据权利要求25的自动方法，其中所说的至少一种调节试剂包含离子或非离子的表面活性剂，表面活性剂选自Triton X-100，吐温，Brij，十二烷基硫酸钠和皂素。
29．在生物学染色过程中调节细胞状态的同时从生物学标本上除去包埋介质的自动方法，此方法包括以下步骤应用暴露和调节细胞状态的试剂；对生物学标本加热；应用流质除去暴露和调节细胞状态的试剂；和染色生物学标本。
30．根据权利要求29的自动方法，其中加热步骤包括加热生物学标本至室温至130℃。
31．根据权利要求29的自动方法，其中暴露和调节细胞状态的试剂选自空气，去离子水，柠檬酸盐缓冲液(pH6.0-8.0)，Tris-盐酸缓冲液(pH6-10)，磷酸盐缓冲液(pH6.0-8.0)，SSC缓冲液，APK WashTM，酸性缓冲液或溶液(pH1-6.9)，碱性缓冲液或溶液(pH7.1-14)，矿物油，Norpar,canola油，和PAG油。
32．根据权利要求29的自动方法，其中暴露和调节细胞状态的试剂包含离子的或非离子的表面活性剂，表面活性剂选自Triton X-100，吐温，Brij，十二烷基硫酸钠和皂素。
33．在生物学染色过程中从生物学标本上除去或浸蚀包埋介质，随后调节细胞状态的自动方法，此方法包括以下步骤对生物学标本加热；对生物学标本使用第一种流质以除去包埋介质或浸蚀试剂；应用调节细胞状态的试剂；应用第二种流质除去调节细胞状态的试剂；和染色生物学标本。
34．根据权利要求33的自动方法，其中加热步骤包括加热生物学标本至室温至130℃。
35．根据权利要求33的自动方法，进一步包括在生物学标本上应用暴露试剂的步骤。
36．根据权利要求35的自动方法，其中暴露试剂选自空气，去离子水，柠檬酸盐缓冲液(pH6.0-8.0)，Tris-盐酸缓冲液(pH6-10)，磷酸盐缓冲液(pH6.0-8.0)，SSC缓冲液，APK WashTM，酸性缓冲液或溶液(pH1-6.9)，碱性缓冲液或溶液(pH7.1-14)，矿物油，Norpar,canola油，和PAG油。
37．根据权利要求35的自动方法，其中暴露试剂包含离子或非离子的表面活性剂，表面活性剂选自Triton X-100，吐温，Brij，十二烷基硫酸钠和皂素。
全文摘要
本发明提供一种在不依赖有机溶剂的条件下通过暴露用于组织化学或细胞化学染色过程的生物学标本除去或浸蚀包埋介质的自动方法。此方法包括生物学标本片与热平台接触，加热或不加热，用或不用液体，使从生物学标本上除去或浸蚀包埋介质更容易。本发明还提供一种用于生物学标本调节细胞状态的自动方法，其中细胞被预处理以使组织化学或细胞化学染色过程中的试剂分子进入。此方法包括生物学标本片与热平台接触，加热或不加热，用或不用液体，使分子易于进入生物学标本内的细胞和细胞组分中。
文档编号G01N1/30GK1317085SQ99810625
公开日2001年10月10日 申请日期1999年9月3日 优先权日1998年9月3日
发明者金伯利·克里斯坦森, 埃塞尔·麦克雷, 诺埃米·塞巴斯蒂奥 申请人:文塔纳医疗系统公司