br> 先打开细胞培养基中大气颗粒物采集装置可调泵14，调节进入导气软管5的空气流量至试验所需的肺活量，并设置好每分钟呼吸次数20次，然后打开温度测定控制系统7和加热系统9，调节筒体下层的温度至细胞正常生长所需的温度35?37°C。参数调节好后，将无菌水注入U型管15中，防止外部细菌进入，影响试验结果；然后将培养有细胞的细胞培养皿通过细胞培养皿进口放于培养皿放置平台11上，导气软管5的下端和U型管15的内端均插入细胞培养皿中，在定时器13上设置好暴露时间6h。工作时，可调泵14将外界空气抽至滤膜2，筛去大粒径颗粒物，获得所需的小粒径颗粒物。外界空气经滤膜2过滤后，进入导气软管5，接受紫外灭菌灯4照射，对颗粒物进行灭菌，灭菌后的颗粒物进入无菌细胞培养液中，多余气体通过U型管15排出，进入空气。试验结束后，由于导气软管5和U型管15内无空气流动，两个单向阀6均自动闭合，取出细胞培养皿。
[0014]步骤(3).在步骤(2)进行的同时对该雾霾区域进行颗粒物收集，检测其颗粒物粒径、重金属浓度以及其他有机与无机成分，并检测空气中PMlO和PM2.5浓度，即为雾霾颗粒物检测结果；
采用宽范围粒子谱法检测颗粒物粒径、采用原子吸收法检测重金属浓度、采用气相质谱法有机污染物浓度、采用紫外光度法检测O3、离子色谱法检测硫化物，并采用国标重量法检测空气中PMlO和PM2.5浓度。
[0015]颗粒物收集时间与染毒过程中的暴露时间一致；
检测后可得到粒物粒径分布:粒径小于0.5 μ m, x% ;粒径大于0.5 μ m小于I μ m, x% ；粒径大于Iym小于1.8 μ m, x% ;粒径大于1.8 μ m小于2.5 μ m, x% ;粒径大于2.5 μ m小于10 μ m, x%0 重金属 Cu、Zn、Fe、Pb 浓度为 χ μ g/m3, χ μ g/m3, x μ g/m3和 x μ g/m 3。O3和硫化物浓度 χ μ g/m3和 χ μ g/m 3ο PMlO 和 PM2.5 浓度为 χ μ g/m3和 χ μ g/m 3。
[0016]步骤(4).接着把步骤(2)染毒好的细胞放入细胞阻抗测量仪，检测其细胞恢复能力，趋化迁移能力和抵御侵润能力，得到此时雾霾区域的细胞活性检测结果，见图3、图4、图5 ；
图3为细胞恢复能力分析图:电击单细胞层后，引起阻抗值降低，随时间的延长曲线回升至初始数值，通过恢复时间(h)评价细胞恢复能力。
[0017]图4为细胞趋化迁移能力图:当细胞从电极板一侧迁移至另一侧时，可测出细胞层电阻值变化，即上升迁入，下降迁出，根据迁入迁出时间(h)评价细胞趋化迁移能力。
[0018]图5为细胞抵御侵润能力图:分别向含RTE细胞层的电极孔中加入G细胞。当RTE细胞受损，抵御侵润能力降低，相比对照组(未受损RTE细胞)，阻抗曲线下降显著，根据阻抗下降比例(％)从而评价细胞抵御侵润能力。
[0019]步骤(5).根据步骤(4)得到细胞活性检测结果与步骤(3)得到的雾霾颗粒物检测结果进行相关性分析，综合评价比较不同雾霾区域下不同种类雾霾颗粒物对大鼠气管上皮细胞的毒效应。
[0020]采用SPSS软件对细胞阻抗测量仪结果与雾霾颗粒物检测结果进行线性相关分析。例如，考察空气中重金属Zn对RTE细胞恢复能力的影响，可将每个采样点所对应的Zn浓度和RTE细胞恢复能力绘制成散点图，并根据SPSS软件和散点分布得到r值。当r >0.8时，重金属Zn浓度越高，RTE细胞恢复能力越弱；当r <-0.8时，重金属Zn浓度越高，RTE细胞恢复能力越强；当0.8>r>-0.8时，重金属Zn浓度与RTE细胞恢复能力无关。采用此方法可分析各雾霾颗粒物参数与RTE细胞恢复能力，趋化迁移能力和抵御侵润能力的关系，从而综合评价雾霾污染物的毒性。
[0021]上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种雾霾污染物毒性评价方法，其特征在于该方法包括以下步骤: 步骤(I).将RTE大鼠气管上皮细胞系接种到含胎牛血清的F12培养液中，置于37°C无菌细胞培养箱中培养3?4天；将培养好的细胞接种至培养皿中，每个培养皿接种5 X 16?8 X 16个大鼠气管上皮细胞； 所述的含胎牛血清的F12培养液中胎牛血清的体积含量为3?7 % ; 步骤(2).将步骤(I)细胞培养皿置于放置在雾霾区域的细胞培养基中大气颗粒物采集装置中，在细胞正常生长所需的温度下对细胞进行染毒； 步骤(3).在步骤(2)进行的同时对该雾霾区域进行颗粒物收集，检测其颗粒物粒径、重金属浓度以及其他有机与无机成分，并检测空气中PMlO和PM2.5浓度，即为雾霾颗粒物检测结果； 所述的颗粒物收集时间与染毒过程中的暴露时间一致； 步骤(4).把步骤(2)染毒好的细胞放入细胞阻抗测量仪，该仪器采用ECIS技术，通过微电流传感器实时、定量、非介入性的测量由于细胞贴壁状态、位置、形态等方面发生的电流变化，从而检测其细胞恢复能力，趋化迁移能力和抵御侵润能力，得到此时雾霾区域的细胞活性检测结果； 步骤(5).根据步骤(4)得到细胞活性检测结果与步骤(3)得到的雾霾颗粒物检测结果进行相关性分析，综合评价比较不同雾霾区域下不同种类雾霾颗粒物对大鼠气管上皮细胞的毒效应。
2.如权利要求1所述的一种雾霾污染物毒性评价方法，其特征在于步骤(I)所述的含胎牛血清的F12培养液中胎牛血清的体积含量为5 %。
3.如权利要求1所述的一种雾霾污染物毒性评价方法，其特征在于步骤(I)所述的培养皿直径为5cm，高度为1cm，使用前需进行灭菌。
4.如权利要求1所述的一种雾霾污染物毒性评价方法，其特征在于步骤(2)所述的染毒方式采用模拟人体呼吸，空气流量可根据试验所需的肺活量进行设定；染毒时间即为细胞在装置中的暴露时间，可根据试验要求进行设定；细胞正常生长所需的温度为35?37。。。
5.如权利要求1所述的一种雾霾污染物毒性评价方法，其特征在于步骤(3)所述的检测过程具体是采用宽范围粒子谱法检测颗粒物粒径、采用原子吸收法检测重金属浓度、采用气相质谱法有机污染物浓度、采用紫外光度法检测O3、离子色谱法检测硫化物，并采用国标重量法检测空气中PMlO和PM2.5浓度。
6.如权利要求1所述的一种雾霾污染物毒性评价方法，其特征在于步骤(5)具体是采用SPSS软件对步骤(4)得到细胞活性检测结果与步骤(3)得到的雾霾颗粒物检测结果进行线性相关分析。
【专利摘要】本发明公开一种雾霾污染物毒性评价方法。该方法是将RTE大鼠气管上皮细胞系接种培养，接种至培养皿；将细胞培养皿置于细胞培养基中大气颗粒物采集装置中对细胞进行染毒；同时对该雾霾区域进行颗粒物收集，检测其颗粒物粒径、重金属浓度以及其他有机与无机成分，并检测空气中PM10和PM2.5浓度；把染毒好的细胞放入细胞阻抗测量仪，检测其细胞恢复能力，趋化迁移能力和抵御侵润能力；综合评价比较不同雾霾区域下不同种类雾霾颗粒物对大鼠气管上皮细胞的毒效应。本发明相比传统毒性评价方法，所使用的ECIS技术具有更大的灵活性，获得的数据是实时变化的，含义更为丰富；取材方便，可排除个体差异对实验的影响，且不涉及伦理问题。
【IPC分类】G01N27-02
【公开号】CN104569068
【申请号】CN201410828594
【发明人】张杭君, 方文迪, 王彬浩, 曾少媛
【申请人】杭州师范大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月26日