生理条件下的新动态光谱方法
【专利说明】生理条件下的新动态光谱方法
[0001] 本发明涉及动态光谱学领域，更精确地说，涉及一种包括设计为确定生理以及病 理条件下分子构象和组装体（assembly)的过渡性变化（transitional change)的动态分 子光谱技术。所述方法包括在严格控制的温度下取得样品体外指纹图谱，以获得一个或全 部分子动态的精准图像。由于其精确信息，本发明方法允许缩短药物发现阶段。
[0002] 在过去的二十年间，确定分子间相互作用尤其是蛋白质-蛋白质相互作用一直是 制药公司面临的重要挑战之一。事实上，药物研发正处在较少创新从而使生产力低下的阶 段。药物发现项目的成功依靠从基础研宄、靶标验证等获得的知识的丰富度和准确度。基 础研宄取决于用于解决生物问题的方法、工具和技术的针对性以及局限性。药物发现和研 发停滞不前的这一事实表明现有的方法和技术无法满足治疗需要。而且，现有药物研发方 案耗时太长，成本太高。
[0003] 有几个原因可以解释制药公司为何对蛋白质-蛋白质相互作用研宄感兴趣，并 且，一些主要的公司允许对涉及生物体特定功能活性的蛋白质进行鉴定，确定对应靶标并 由此确定对应受体，然后鉴定并验证所述治疗革G标和药效结构（pharmacophore)，以及最后 设计并研发能够结合鉴定的受体、优化先导化合物并最终构建候选药物的分子。这是传统 的药物发现和研发方案。事实上，建立药物研发策略需要的所有信息均来自间接探索方法， 其中天然靶标用复制本或部分相同的结构代替。所有这些方法均基于基因修饰或化学修饰 的修饰靶标，即纯蛋白、蛋白嵌合体、突变蛋白、缀合物、敲除蛋白（knock out)等。这些方 法和尖端技术均未全面考虑到生物体。相反，它们的重点在于特异性信号级联中的特定靶 标，这对于体外和体内研宄都是有效的。
[0004] 不幸的是，付出如此巨大精力进行研发获得的成果仍然非常小，并且，在某些情况 下由于诸如靶标验证、先导优化等多种问题失败了。许多失败都是由于使用了不适合该情 况的技术或使用了太简单的生理的但验证的研宄模型。而且，许多级联对齐的步骤，无论是 否适合，仅以前一个步骤的效率为基础。结果，不确定性或近似性导致了失败。
[0005] 此外，制药行业正面临新的需求，因为传统的药物研发仍然效率低下并且对于新 疗法的开发不利。医生似乎更注重预防和治疗医学，而不是对症治疗。需要研宄并理解给 定疾病的病理生理学的方法和技术。也需要给出关于分子间相互作用的性质的准确信息， 允许对不同的分子作用子（actor)进行鉴定，允许对靶标受体进行鉴定并且允许选择具有 有益治疗效果的特异性配体的方法。理想地，所述方法是互补的，并且彼此依赖以克服现有 技术的缺陷。
[0006] 作为现有技术的一个实例，我们可以提及如Wubiao D.等人 (Organic&Biomolecular Chemistry, 2005,vol. 3,n ° 13)或 Tung CH?等人 (Chembiochem，2003, 4 (9) : 897-9)中所描述的使用近红外发光标签如荧光素的光谱学 方法。这类技术包括至少一个对感兴趣的分子进行标记的步骤，并且该步骤导致废除 (abolition)含有感兴趣的分子的样品的生理条件。作为现有技术的另一实例，我们可以 提及描述使用近红外光谱检测生理上可接受的聚合物分子的方法的专利申请EP23566467。 所述方法以使用近红外光谱对结合在感兴趣的蛋白质上的聚合物的量进行的检测为基础， 并且，对每个蛋白质分子的聚合物部分的量的测量允许生产具有相同量的聚合物部分的分 子，这有助于药物组合物的生产。当与先前计算的具有与感兴趣的蛋白质缀合的已知量的 聚合物分子的标准比较时，得到结果。所述方法包括纯化和浓缩感兴趣的蛋白质，所以废除 了生理条件，并且另一缺陷在于需要参考或标准来对研宄做出结论。此外，该方法是以荧光 素的NIR光谱为基础，而不是感兴趣的蛋白质的周围环境。
[0007] 专利申请W02008/115120描述了一种检测含水样品中物质的结合和反应的方法， 其中，所述结合或反应改变了水的光谱性质，并且所述结合或反应是通过观察或测量水光 谱性质的任何变化而测得。该文献仅涉及一种概念，因为未对方法进行完整地描述也没有 通过数据进行说明。而且，W02008/115120的方法不依赖于用于测量光谱性质变化的任何 特定检测装置，并且同样使用红外、拉曼、太赫兹、和频（sum frequency generation)或光 声光谱、或振动圆二色谱。
[0008] 急需一种更高效的基本的转化开发策略以克服上述缺陷。理想地，该新方法应该 是以一步探索技术为基础，其中其结果反映了一个分子或全部分子对特定刺激或多种刺激 的活动行为。其在正常和病理条件下也应该是与从人体获得的信号一样精确的体外信号。 最后，所述方法应该考虑到整个信号级联内给定刺激之后生物体中产生的所有变化，而不 是仅考虑选择的反应，如隔离信号。
[0009] 本发明涉及一种含有感兴趣的生物分子的样品的构象分析方法，其中，所述分析 是通过对包围感兴趣的分子的水分子的近红外波长进行光谱分析来实现的。光谱分析得 到通过图形或三维图像以及数据采集和处理物化的感兴趣的分子的指纹图谱或空间指纹 图谱。本发明还涉及一种提供分子体外指纹图谱的方法，所述指纹图谱表示生理和病理条 件下体内分子的相互作用。本发明的方法可在存在或不存在维生素、微量元素、cAMP、ADP、 ATP、cGMP、⑶P、GTP、NADH、NADPH、FAD、FADH2、或在给定细胞、组织、器官或有机体中参与天 然分子相互作用以满足生理需要或以参与疾病的病理生理机制的任何其它分子时，应用于 分子、大分子、蛋白质、蛋白质复合物、糖蛋白、脂蛋白、至少一种或多种或两个或更多核酸、 DNA、所有已知形式的RNA、蛋白质、糖蛋白和脂蛋白的一种或多种多组装体。
[0010] 事实上，分子相互作用遵从热力学定律。这意味着，分子内的、或与其所在环境有 关的或与相同环境内的另一分子的所有相互作用均力图达到最低能量状态。也就是说，从 最高亚稳能量状态进入最低亚稳能量状态最后达到稳定状态。后者称为分子自组装理论。 活细胞内的分子相互作用，虽然受该相同热力学理论限制，但是不遵从自组装理论。这都 是由于ATP。热力学分子相互作用以及ATP都是确保细胞活性并因此保持其生理机能的主 要作用子。分子相互作用的级联是多样的并且短暂的。信号级联内的所有作用子固有地 且与周围分子有关地不断改变其构象。这解释了它们作为信号级联作用的转化演变。在 极短时间内，给定蛋白质起到受体的作用，且在另一短时间内，其变成结构伙伴（structure partner)或代替效应子的作用。当设计新研宄方法和开发适合技术时，必须考虑这些快速 转化。
[0011] 现有技术中，通过光谱法在波长范围为260nm和280nm之间时进行三维分子分析。 所得图像取决于芳香族氨基酸上的光吸收。当波长更大时，没有更多吸收，因此没有更多信 息。在红外范围内，所得图像取决于碳原子吸收。所有已知方法如结晶学和核磁共振需要 纯样品或特定条件如在有机溶剂中稀释。所有已知方法均得到三维图像及由此的分析，但 它们没有一个可在生理条件中进行。
[0012] 如上述详细说明，现有技术中未已知下面的使用光谱技术在近红外范围内测定的 生理条件下的生物分子构象。在近红外范围内进行的优点是其允许测量水分子的光强透射 率light intensity transmission)。并且由于对这些数据的分析，数据处理之后，获得示 出由所述水分子包围的分子的空间指纹图谱的图形和三维图像。本发明基于对不同情况中 水分子和其各种伙伴之间的构象平衡情况的观察。本发明给出水分子的动态指纹图谱或空 间指纹图谱，并因此允许说明被观察的水分子包围的分子之间的相互作用。
[0013] 对生理条件中所有分子相互作用必需的最重要的分子是水。其作为介质存在于 大分子周围以及作为伙伴存在于蛋白质内，这使得分子相互作用不仅是可能的而且是动态 的。这意味着如果其不存在，所有相互作用会停止。如果水分子失去其谐振和内在作用，也 会发生停止。当水冻住时，会发生停止。在这种情况下，水结晶是获得大分子指纹图谱的理 想介质。这些可在恒温下进行，从而获得稳定的指纹图谱或在不同温度下进行，从而获得动 态指纹图谱。
[0014] 本发明的体外指纹图谱是基于从亚稳态到稳态再到亚稳态构象的水分子动态构 象，在严格控制的温度即逐步从-37°c升至37°C再回到-37°c时于恒定谐振中获得的。在存 在生理介质即与具有可比较阴离子、阳离子、微量元素、维生素、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、月旨 质、糖、核酸，简言之具有整个细胞质的活细胞内的一样时，于其生理构象中获得指纹图谱。
[0015] 本发明提供在生理条件下使用光谱获得样品中至少一种感兴趣的生物分子的指 纹图谱的方法，其包括：
[0016] a)将样品暴露于近红外光谱中的光源下；
[0017] b)测量包围感兴趣的生物分子的水分子的光强透射率；
[0018] c)测定所述感兴趣的生物分子的指纹图谱。
[0019] 在第一实施方案中，在近红外波长范围内于不断增大的波长下使用本发明的方 法。在第二实施方案中，在近红外波长范围内选择的给定波长下进行本发明的方法。
[0020] 本发明以前述原理为基础，涉及提供体外动态分子指纹图谱的方法，其中所述方 法包括以下步