嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒及其使用方法，具体涉及流式细 胞术法检测嗜碱性粒细胞活化的试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 目前，过敏性疾病的发病率在全球呈逐年升高的趋势，特别是在发展中国家，因环 境污染、食品卫生等造成的过敏性疾病逐渐引起了大家的重视，该类疾病所占医疗资源比 例环比上升，且显著影响患者的生活质量。
[0003] 嗜碱性粒细胞（Basophil)已被认知130余年，是过敏性疾病的主要效应细胞（潘 庆军等，中国免疫学杂志，2009, 23(1) :25-28)。研宄发现，活化是嗜碱性粒细胞发挥其生 物学功能的关键步骤，对其活化机制的研宄，也已从经典的IgE介导的活化，发展到多途径 的活化机制，包括细胞因子、抗体、蛋白酶、Toll样受体配体和补体介导的一系列信号所活 化（中国免疫学杂志.2013, 29(8) :816-818)。嗜碱性粒细胞被活化后，可释放胞内众多 效应分子，包括组胺、白三烯、抗微生物肽，以及IL-4、IL-5、IL-13和多种趋化因子等，上调 其活化相关膜标记物如CD63和CD203c等（潘庆军等，现代免疫学，2014, 34(3) :246-249 ; Chirumbolo S, Blood Transfus, 2012, 10 (2) : 148-164)。近年来，CD63 和 CD203c 作为 嗜碱性粒细胞活化标记蛋白已被广泛应用，嗜碱性粒细胞固有表达CD203c，当活化时 ⑶203c的表达进一步上调，而仅有活化的嗜碱性粒细胞才表达⑶63 (潘庆军等，现代免疫 学，2014, 34(3) :246-249)。但近年发现，不同处理因素如不同红细胞裂解液（潘庆军等，J Immunoassay Immunochem. 2014, 35 (4) : 368-377)，某些信号分子特异的激动剂或阻断剂对 膜上⑶63和⑶203c表达的影响并不同，且⑶63和⑶203c代表着嗜碱性粒细胞内两种不 同的活化信号，并且都有优缺点（潘庆军等，现代免疫学，2014, 34(3) :246-249)。因此，基 于近年研宄新进展，⑶63和⑶203C联合检测，才能准确、全面的识别活化的外周血嗜碱性 粒细胞。
[0004] 检测人外周血嗜碱性粒细胞活化情况的方法，主要有嗜碱性粒细胞脱颗粒实验 (Human basophil degranulation test, HBDT)和流式细胞术（Flow Cytometry, FCM)定 量检测嗜碱性粒细胞活化实验（Basophil activation test, BAT)等，但HBDT灵敏度和 特性不如BAT，且重复性较差。因此，目前活化嗜碱性粒细胞检测常用BAT。FCM检测时， 尽管嗜碱性粒细胞活化指标相对固定（CD63和CD203c等），但其识别抗体（或免疫学指 标）并不统一，如人嗜碱性粒细胞是否表达HLA-DR尚存争议（Sci R印.2013 ;3:1188 ;Nat Med. 2010, 16(6) :701-707)。因此，基于近年研宄新进展，多参数联合检测，才能准确、全面 的识别外周血嗜碱性粒细胞。
[0005] 另外，嗜碱性粒细胞活化及其检测过程受诸多因素的影响，如血清采集过程（抗 凝剂的选择）、全血还是分离的白细胞、是否加入IL-3及其浓度、过敏原（浓度和时间）、红 细胞裂解液（类型）（潘庆军等，J Immunoassay Immunochem. 35:368-377, 2014 ；Pichler WJ(ed) :Drug Hypersensitivity. Basel, Karger, 2007, 391-402)、识别参数的选择、活化阈 值的设定（活化指标的变化程度）等，这些因素可能影响活化结果的判断，进而临床疾病的 诊断。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷而提供一种采用流式细胞术检测嗜 碱性粒细胞活化的新试剂盒及其使用方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种嗜碱性粒细胞活化的检测试剂 盒，包括洗涤液、刺激物对照品、带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体、红细胞裂解液、抗 体染色液；其中，所述带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体中，嗜碱性粒细胞识别抗体为 Anti human CDllb、Anti human CD123、Anti human CD203c和 Anti human CD63,且不同的 嗜碱性粒细胞识别抗体带有不同的荧光标记。
[0008] 作为本发明所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的优选实施方式，所述洗涤液为 1\卩85，每比洗涤液中含 ：8.5~42.58恥(：1、0.2~1.(^1((：1、0.1~0.58〇3(：12、0.1~ 0· 5g MgCl2. 6Η20、1· 42 ~7. Ig Na2HPO4. 2Η20、0· 2 ~1.0 g KH2PO40
[0009] 作为本发明所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的优选实施方式，所述带有荧 光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体为FITC-anti human Q)llb、PerCP-anti human 0)123、 PE-anti human CD203c和APC-anti human CD63。当然，焚光标记除以上焚光素搭配外，也 可为满足流式细胞仪检测通道要求的其他荧光素搭配。
[0010] 作为本发明所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的优选实施方式，所述刺激物 对照品包括阳性对照品I、阳性对照品II、过敏原和阴性对照品；所述阳性对照品I为 0· 05~10ng/mL的anti-human Fc ε R I α抗体；所述阳性对照品Π为1~l〇〇nmol/L的 fMLP (N-甲酰-L-甲硫氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酸三肽）。fMLP是一种可引起嗜碱性粒 细胞以IgE方式活化的三肽。
[0011] 作为本发明所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的优选实施方式，所述阴性对照 品为1XPBS。
[0012] 作为本发明所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的优选实施方式，所述红细胞裂 解液的pH值为6. 8~7. 5,其含有以下浓度的组分：50~200mmol/LNH4Cl、5~20mmol/L NaHCOjP 0. 1~lOmmol/L EDTA ;所述抗体染色液为含有质量百分比浓度为0. 1~0. 8% 的牛血清白蛋白（BSA)、并含有0.02~0.25 % (w/v)的NaN3或0.01~0.05 % (w/v)的 ProClin300的IXPBS。更优选地，所述红细胞裂解液还含有5~20% (v/v)的甲醛和5~ 50% (v/v)的二甘醇（Diethylene glycol)。
[0013] 本发明还提供了上述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的使用方法，所述试剂盒的 使用方法包括以下步骤：
[0014] (1)标本采集：用含有EDTA-K2或肝素的抗凝真空采血管收集检测对象的静脉血 液，得到全血标本，备用；
[0015] (2)刺激和抗体染色：取4支流式管，先向每管中均加入相同体积的洗涤液；然后 于各管中分别加入相同体积的刺激物对照品，刺激物对照品为阴性对照品、阳性对照品I、 阳性对照品II和过敏原；再向每支流式管中加入步骤⑴得到的全血标本，各管加入的全 血标本的体积相同，混匀；最后向各管中加入带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体和抗 体染色液，再次混匀，于35~37°C避光孵育10~30分钟；
[0016] (3)裂解红细胞：向步骤⑵孵育后的各流式管中加入红细胞裂解液，混勾，避光 孵育（孵育的温度为室温）；孵育完后，离心，倒出上清液，用洗涤液重悬细胞并进行轻微涡 旋，得到细胞悬液；
[0017] (4)流式细胞仪检测与数据分析：采用流式细胞仪检测步骤（3)得到的细胞悬液， 识别 Anti human CDllb+/Anti human CD123+/Anti human CD203c+的嗜喊性粒细胞，计算 嗜碱性粒细胞活化百分比与活化程度。
[0018] 本发明采集到的全血标本，可直接用于嗜碱性粒细胞活化检测或将其于2~8°C 冷藏存放（冷藏时间不超过24小时，不能离心或者冷冻）。另外，除全血标本外，分离的白 细