下步骤：
[0047] (1)标本采集：用含有EDTA的抗凝真空采血管收集检测对象的静脉血液，得到全 血标本，备用；
[0048] (2)刺激和抗体染色：取4支流式管，先向每管中均加入IOOyL IXPBS ;然后于 各管中分别加入阴性对照品（用作空白对照）、阳性对照品I (用作刺激对照）、阳性对照 品II (用作刺激对照）和过敏原（检测管）各50 μ L ;再向每支流式管中加入50 μ L步骤 (1)得到的全血标本，轻轻混匀；最后，向各管中加入2 μ L带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识 别抗体和18 μ L抗体染色液，再次轻轻混匀，盖好流式管盖，于37°C避光孵育15分钟；
[0049] (3)裂解红细胞：向步骤⑵孵育后的各流式管中加入2mL红细胞裂解液，轻轻混 匀，室温避光孵育10分钟；孵育完后，以400Xg的离心力离心8分钟，轻轻倒出上清液，用 300 μ L I XPBS重悬细胞并进行轻微涡旋，得到细胞悬液；
[0050] (4)流式细胞仪检测与数据分析：按流式常规检测方法，在流式细胞仪上进行多 参数识别嗜碱性粒细胞，并用流式分析软件如Flowjo、FloMax和CellQuest等进行数据分 析；采用流式细胞术检测嗜碱性粒细胞活化的过程如图1所示。
[0051] 按下述两种方法计算嗜碱性粒细胞活化百分比与活化程度：①以高表达CD203C 为活化标记：活化百分比=(高表达⑶203c的嗜碱性粒细胞/表达⑶203c的嗜碱性粒细 胞）X 100%，活化程度=高表达⑶203c的嗜碱性粒细胞表达⑶203c的平均荧光信号强度； ②以表达⑶63为活化标记：活化百分比=(表达⑶63的嗜碱性粒细胞/表达⑶203c的嗜 碱性粒细胞）X 100%，活化程度=表达⑶63的嗜碱性粒细胞表达⑶63的平均荧光信号强 度。
[0052] 以高表达⑶203c为活化标记，计算活化百分比与活化程度的结果如表1所示；以 表达CD63为活化标记计算活化百分比与活化程度的结果如表2所示。结果提示，对于两 种计算嗜碱性粒细胞活化百分比与活化程度的方法，空白对照未诱导患者嗜碱性粒细胞活 化，但阳性对照I和II可显著诱导患者嗜碱性粒细胞活化，且6例患者均对花粉过敏，以患 者3和6最显著。
[0053] 表 1
[0054]
【主权项】
1. 一种嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒，其特征在于：所述嗜碱性粒细胞活化的检测 试剂盒包括洗涤液、刺激物对照品、带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体、红细胞裂解 液、抗体染色液；其中，所述带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体中，嗜碱性粒细胞识别 抗体为 Anti human CDllb、Anti human CD123、Anti human CD203c 和 Anti human CD63， 且不同的嗜碱性粒细胞识别抗体带有不同的荧光标记。
2. 如权利要求1所述的嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为 1XPBS，每 1L 洗涤液中含：8. 5 ~42. 5g NaCl、0. 2 ~1. Og KC1、0. 1 ~0? 5g CaCl2、0. 1 ~ 0? 5g MgCl2. 6H20、1. 42 ~7. lg Na2HP04. 2H20、0. 2 ~1. Og KH2P04。
3. 如权利要求1所述的嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒，其特征在于：所述带有荧 光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体为FITC-anti human Q)llb、PerCP-anti human 0)123、 PE-anti human CD203c 和 APC-anti human CD63〇
4. 如权利要求1所述的嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒，其特征在于：所述刺激物 对照品包括阳性对照品I、阳性对照品II、过敏原和阴性对照品；所述阳性对照品I为 0? 05~10ng/mL的anti-human Fc e R I a抗体；所述阳性对照品II为1~l〇〇nmol/L的 fMLP〇
5. 如权利要求4所述的嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照 品为1XPBS。
6. 如权利要求1或4所述的嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒，其特征在于：所述红 细胞裂解液的pH值为6. 8~7. 5,其含有以下浓度的组分：50~200mmol/L NH4C1、5~ 20mmol/L NaHC03和 0? 1 ~10mmol/L EDTA ; 所述抗体染色液为含有质量百分比浓度为〇. 1~〇. 8 %的牛血清白蛋白、并含有 0.02 ~0.25% (w/v) NaN3 或 0? 01 ~0? 05 % (w/v) ProCl in300 的 1 X PBS 〇
7. 如权利要求6所述的嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒，其特征在于：所述红细胞裂 解液还含有5~20% (v/v)的甲醛和5~50% (v/v)的二甘醇。
8. -种如权利要求4所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的使用方法，其特征在于： 所述试剂盒的使用方法包括以下步骤： (1) 标本采集：用含有￡01八-1(2或肝素的抗凝真空采血管收集检测对象的静脉血液，得 到全血标本，备用； (2) 刺激和抗体染色：取4支流式管，先向每管中均加入相同体积的洗涤液；然后于各 管中分别加入相同体积的刺激物对照品，刺激物对照品为阴性对照品、阳性对照品I、阳性 对照品II和过敏原；再向每支流式管中加入步骤（1)得到的全血标本，各管加入的全血标 本的体积相同，混匀；最后向各管中加入带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体和抗体染 色液，再次混匀，于35~37°C下避光孵育10~30分钟； (3) 裂解红细胞：向步骤⑵孵育后的各流式管中加入红细胞裂解液，混勾，避光孵育； 孵育完后，离心，倒出上清液，用洗涤液重悬细胞并进行涡旋，得到细胞悬液； (4) 流式细胞仪检测与数据分析：采用流式细胞仪检测步骤（3)得到的细胞悬液，识别 Anti human CDllb+/Anti human CD123+/Anti human CD203c+的嗜喊性粒细胞，计算嗜喊性 粒细胞活化百分比与活化程度。
9. 如权利要求8所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的使用方法，其特征在于： 所述步骤（2)中，带有焚光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体为FITC-anti human⑶lib、 PerCP-anti human CD123、PE-anti human CD203c 和 APC-anti human CD63〇
10.如权利要求8所述嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所 述步骤（4)中，按下述两种方法计算嗜碱性粒细胞活化百分比与活化程度：①以高表达 ⑶203c为活化标记：活化百分比=(高表达⑶203c的嗜碱性粒细胞/表达⑶203c的嗜 碱性粒细胞）X 100%，活化程度=高表达⑶203c的嗜碱性粒细胞表达⑶203c的平均荧光 信号强度；②以表达CD63为活化标记：活化百分比=(表达CD63的嗜碱性粒细胞/表达 ⑶203c的嗜碱性粒细胞）X 100%，活化程度=表达⑶63的嗜碱性粒细胞表达⑶63的平均 焚光信号强度。
【专利摘要】本发明提供一种嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒及其使用方法，本发明的检测试剂盒包括洗涤液、刺激物对照品、带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体、红细胞裂解液、抗体染色液；其中，所述带有荧光标记的嗜碱性粒细胞识别抗体中，嗜碱性粒细胞识别抗体为Anti human CD11b、Anti human CD123、Anti human CD203c和Anti human CD63，且不同的嗜碱性粒细胞识别抗体带有不同的荧光标记。采用本发明的试剂盒检测嗜碱性粒细胞活化情况可规避目前已知的嗜碱性粒细胞活化及检测的影响因素，全面、准确的识别和检测嗜碱性粒细胞活化情况，能更好服务于临床或科研上嗜碱性粒细胞活化的检测。
【IPC分类】G01N15-14
【公开号】CN104677810
【申请号】CN201510050527
【发明人】潘庆军, 刘华锋, 刘伟敬, 彭浩晟, 叶玲, 冯永民, 邓真真, 李璐, 唐培 , 兰巧芬, 吴静, 陈燕文
【申请人】广东医学院附属医院
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年1月30日