一种基于lc-ms血清代谢组学技术分析血清代谢组学的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于LC-MS血清代谢组学技术分析血清代谢组学的方法，该方法 可以方便、快捷对食管癌进行早期初步筛查，属于分析技术领域。
【背景技术】
[0002] 食管癌（esophagealcancer)是由食管鳞状上皮或腺上皮的异常增生所形成的恶 性病变，是由不典型增生到癌的逐渐演变的过程。据世界卫生组织最新数据表明：全世界每 年约有40万人死于食管癌，我国是食管癌发病率和死亡率最高的国家，且90%患者的组织 类型为鳞状细胞癌。山东省汶河流域为食管癌高发区，以肥城市、宁阳县和汶上县最高，发 病率分别为93. 95/10万、88. 68/10万和62. 26/10万，远高于全国一般水平（16. 7/10万)， 尤其是肥城市，其发病率为山东省平均水平的3. 7倍，占到全县肿瘤死因的50%。食管癌的 高发病率和高死亡率给我国尤其是山东省汶河流域造成了巨大的疾病负担和经济负担，已 经成为严重的公共卫生问题，亟待解决。
[0003] 食管癌的病因复杂，多数学者认为是基因与环境共同作用的结果，食管癌发病的 地域聚集性提示其与环境因素及不良生活习惯相关，如膳食成分中维生素与微量元素缺 乏、进食含亚硝胺类较多的食物、如喜欢腌制酸菜或霉变食品、长期喜进烫食、吸烟、饮酒不 良嗜好等。分子学研宄表明食管癌的发生是多因素、多阶段、多基因变异的积累以及各因素 与环境因素相互作用的结果，涉及众多原癌基因、抑癌基因以及蛋白质的改变，以及细胞周 期。从癌前病变到食管癌的发生往往会经历漫长的过程，食管癌的重要癌前病变为食管鳞 状上皮轻、中、重度不典型增生，由轻度不典型增生到癌变一般需要几年甚至十几年。如果 在此期间，癌前病变人群改变不良生活习惯、进行预防性服药，那么将大大降低其癌变的几 率。因此，食管癌癌前病变的早期识别和干预对降低其癌变率显得尤为重要。
[0004]为筛查处于轻度、中度和重度不典型增生的癌前病变状态或早期食管癌的病例， 国家自2008年起在山东省肥城市(全国食管癌早诊早治示范基地)，针对示范基地内的所 有40~69岁的人群，借助胃镜下碘染色指示性活检技术，开展了食管癌早诊早治项目。食 管内镜碘染色检查后对可疑粘膜活检并进行组织病理学检查，是目前食管癌高发区普查、 高危人群筛检和早期诊断中的金标准方法。由于其直观，图像淸晰且特异性高，目前还没 有一种方法能替代其地位。虽然该方法准确度高，但仍具有一定的局限性：胃镜为有创检 查，且受检者感觉痛苦，在执行过程中有不依从现象；胃镜下碘染色指示性活检技术操作 复杂、成本较高，如果在高发的示范区之外推广的可行性及效率仍有待商榷；食管癌高发 区的碘染色阳性率不到10%，高达90%的待筛查人群要承受有创胃镜检查的痛苦，还给国 家早诊早治项目带来了不必要的经济负担。因此，急需开发一种新的更简便的方法，探寻 在食管癌发生发展阶段机体内环境的变化，为食管癌的金标准筛检方法（即胃镜下碘染色 指示性活检技术）提供初筛的科学依据和转化医学支持，以区分碘染色阴性和碘染色阳性 人群，从而避免碘染色阴性人群承受有创胃镜的痛苦并减少早诊早治项目的财政支出。此 外，在食管癌早诊早治项目早期曾试行使用哈佛癌症风险预测模型（问卷涉及的内容包括 生活环境、饮食方式和习惯、心情和情绪、既往病史及恶性肿瘤家族史等五大方面）初步筛 查食管癌高危个体，然后针对高危个体再施行胃镜下碘染色指示性活检技术。但在实际执 行中发现其具有较高的假阴性率（即漏诊)，ROC曲线下面积AUC为0. 70 (95%CI，0. 66 -0? 74)(文献来源：ThriftAP,KendallBJ,PandeyaN,VaughanTL,WhitemanDC.A clinicalriskpredictionmodelforBarrettesophagus.CancerPrevRes(Phila), 2012, 5 (9) : 1115-23.)。由于该传统初筛方法效果不理想，目前食管癌筛查范围仅作40-69 岁的年龄限定。
[0005] 代谢组学是对生物样品（如血清、尿液、唾液等）中所有分子量低于lOOODa小分子 代谢物(如脂肪酸、氨基酸、核苷及留体等生物小分子）进行定性定量检测，从而监测机体受 疾病或危险因素累积等干扰后内源性物质做出的代谢响应。体内的生物信息由基因经转录 传递给蛋白质，最终体现为小分子代谢物。不同于基因组学和蛋白组学反映的生物体内在 差异，代谢组学的研宄领域扩展到了机体与环境之间的相互影响和作用。小分子代谢物不 仅是机体生命活动、生化代谢的物质基础，还体现了某些外来因素对体内代谢环境的改变， 因而某些独特代谢物的浓度在不同个体间的差异事实上反映了疾病内在的表现和外在病 因。近年来研宄发现，诸如代谢性疾病和恶性肿瘤(卵巢癌)等疾病发生发展过程中，机体基 础生化代谢均发生了明显变化，对人类理解复杂疾病的代谢机制将发挥重要作用，同时为 复杂疾病的筛检和早期诊断提供崭新的技术方法。
[0006] 食管癌是一种典型的代谢性疾病，在我国90%以上患者为食管鳞状细胞癌 (ESCC)，其通常表现为机体整体的代谢紊乱，因此代谢组学技术和方法非常适合于食管癌 的研宄。目前，已经有人利用代谢组学对食管癌进行研宄，例如Wu等（WuH，XueR，Lu C,etal.Metabolomicstudyfordiagnosticmodelofoesophagealcancerusing gaschromatography/massspectrometry.JChromatogrBAnalytTechno1Biomed LifeSci，2009,877(27):3111_7.)、Zhang等（ZhangJ，BowersJ，LiuL，etal. EsophagealcancermetabolitebiomarkersdetectedbyLC-MSandNMRmethods. PLoSOne, 2012, 7(1):e30181.)、Xu等（XuJ，ChenY，ZhangR，etal.Global andtargetedmetabolomicsofesophagealsquamouscellcarcinomadiscovers potentialdiagnosticandtherapeuticbiomarkers.MolCellProteomics, 2013, 12(5) : 1306-18.)都利用代谢组学技术对食管癌进行了研宄，但总体来说这些研宄 大多集中于病理学和发病机制的研宄，为疾病的发生机理提供了新的线索，所使用的样本 也是基于医院采集的食管癌晚期患者的样本，所得的研宄结果仅能发现食管癌发病晚期同 健康对照相比的代谢轮廓差异，而癌症晚期的血清代谢情况与癌前病变的血清代谢差异巨 大，并不能对于食管癌的早期筛检和早期诊断带来帮助。并且，目前上述研宄方法在健康对 照选取上容易受到选择性偏倚影响，造成评价结果的推广性较差。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术中食管癌早期筛查方法繁琐、费用高、对检测人群造成痛苦等不足， 还没有一种简便快捷、适合大范围的缺陷，本发明提供了一种基于LC-MS血清代谢组学技 术分析血清代谢组学的方法，该方法操作简单，能够代替胃镜下碘染色指示性活检技术对 人群进行食管癌早期、初步筛查，既经济实惠、方便快捷，又能避免待检测人群的痛苦，便于 推广应用。
[0008] 本发明针对目前采用胃镜下碘染色指示性活检技术对食管癌进行初步筛查的不 足，首次提出采用血清代谢组学技术代替胃镜下碘染色指示性活检技术对食管癌进行初步 筛查的思路。本发明依托"国家食管癌早诊早治示范基地（山东省肥城市)"的食管癌筛检 与随访人群队列，针对项目中所有胃镜下碘染色指示性活检对象，采集初次发现的上消化 道病变、食管癌癌前病变和食管癌早期患者的血清标本，并随机抽取筛检中无上消化道病 变的健康对象作为对照组，使用快速分离液相色谱和质谱仪（LC/MS)的高通量检测获得相 应的代谢指纹图谱，并通过对图谱的进一步分析构建得到了模型，该模型能够分析辨别血 清代谢物情况，通过血清代谢物情况能够初步判断是否具有食管癌患病危险。利用本发明 模型可以用于高发病区的全人群食管癌早期筛检，筛除没有患病危险的人群，然后再针对 高危个体进行常规内镜检查，判断是否患有食管癌。本发明缩小了内镜检查的范围，对于食 管癌筛检的实施和推广有着重要的经济和社会效益。
[0009] 本发明具体技术方案如下： 一种基于LC-MS血清代谢组学技术分析血清代谢组学的方法，包括以下步骤：取待检 血清样本，将待检血清样本采用LC-MS血清代谢组学技术进行分析，得该待检血清样本的 原始代谢指纹图谱；将该原始代谢指纹图谱进行图谱预处理，得到可以用于统计分析的代 谢物信息；将该代谢物信息导入血清代谢组学分析模型中，找出该代谢物信息在血清代谢 组学分析模型中的位置，用于分析待检血清样本的代谢组学情况； 上述方法中，血清代谢组学分析模型的构建方法，包括以下步骤： (1) 收集健康血清样本和患病血清样本，作为分析样本； (2) 将每个分析