一种河豚毒素的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素的检测方法。
【背景技术】
[0002]中国鲎主要分布于日本的濑户内海和九州岛北岸，越南、西菲律宾的岛屿，苏门达腊和爪哇岛，马来西亚的北婆罗洲以及加里曼丹东岸等海域，在中国主要分布于长江以南的浙江、福建、广东、广西、海南以及台湾等沿海海域，现以福建、广东、广西、海南为多。圆尾鲎分布于中国香港、北部湾、雷州湾、印度尼西亚爪哇岛北岸以北、菲律宾南部以西和恒河河口印度东北部以东的海域。在我国圆尾鲎主要分布于北部湾、雷州半岛西海岸以及海南的西海岸，近年来发现雷州半岛南海岸及以东沿岸均有圆尾鲎的分布，如湛江、香港等地不少海滩也分布有不少的圆尾鲎。我国人民素有吃鲎的习惯，鲎肉似蟹，只是口感较粗。在中国的广东、广西常有食鲎中毒的事件发生。
[0003]河豚毒素(tet1dotoxin，TTX)是一种毒性很强的神经性毒素，它最早从河豚鱼中分离出来的。近年来还发现河豚毒素不仅存在于河豚属的鱼类，还存在于虾虎鱼、章鱼、海星、蟹类以及腹足类，甚至还有鲎等众多的海洋生物中。它们不仅本身有较强的毒性而且可以通过食物链富集等途径，污染其他水产品，给人们食用这些水产品构成极大潜在危险。在东南亚河豚毒素中毒已经成为一个难题，一般都是因为摄取了河豚鱼导致的中毒。因为在日本河豚鱼被作为一道佳肴，所以大多数的河豚中毒事件都是发生在日本。另外，误食不明鱼种也是此类中毒事件发生的重要原因，因而加强对水产品中河豚毒素的监测显得尤为必要，多省地方渔业局已将水产品中河豚毒素作为常规检测项目。河豚毒素的检测方法种类繁多，有生物测定法、理化检测方法、免疫化学测定方法等几大类。小鼠法是最常用和最简便的方法，廖永岩等也在2000年用小白鼠法检测了中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素，但此法具有定量不准确且重复性差等缺点。
【发明内容】
[0004]为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素的方法。
[0005]其技术方案如下:
[0006]一种中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素的检测方法，包括以下步骤:
[0007](I)标准贮备液的配制
[0008]精密称量TTX 1.0mg置于5ml离心管中，用Iml移液枪吸取1.0mL的浓度为0.2%醋酸，使其溶解后即得1.0mg/mL的TTX贮备溶液，置于冰箱中保存；
[0009](2)样品的前处理
[0010]取中国鲎或圆尾鲎待测组织10g，剪碎后加1ml pH = 3.5浓度为0.1 %的醋酸于玻璃匀浆器中匀浆，充分匀浆后将样品置于烧瓶中，加50ml浓度为0.1 %的醋酸，然后在水浴锅中沸水浴10-20分钟，边加热边搅拌，转速控制在150-200r/min，冷却后用0.45 ym滤膜真空抽滤，将滤液放入蒸发皿中，在60-70°C的水浴锅上进行蒸发浓缩，直至10ml，然后过滤定溶至10ml，将浓缩的滤液10ml放在离心管中，经10000r/min的速度，离心15分钟，取上清液经0.22 ym的微孔滤膜过滤后，放入干净的离心管中，作为液相色谱待测液；
[0011](3)液相色谱测试
[0012]醋酸流动相色谱条件固定相:SunFire?C18色谱柱，直径4.6mmX长度150mm，进样量为20 y ;流动相:0.2%醋酸；流速:0.8mL/min ;紫外检测波长:210nm ;柱温:25°C ;每次进样体积为60 y L ;pH为3.0 ;
[0013]磷酸流动相色谱条件固定相:SunFire?C18色谱柱，尺寸为4.6_X 150_，进样量为 20 y 1 ;流动相:0.05mol/L NaH2P04_0.05mol/L Na2HP04，pH = 6.8，庚烷磺酸钠离子对5mM ;流速:lmL/min ;紫外检测波长为200nm ;柱温:25°C;每次进样体积为60 y L ;pH为6.8。
[0014]与现有技术相比，本发明的有益效果:
[0015]1、本发明采用高效液相色谱法检测中国鲎和圆尾鲎体内的的河豚毒素，以便证明鲎体内的毒素到底是不是含有河豚毒素，从而知道是食什么鲎引起食鲎中毒以及含量多少，为食鲎中毒的预防和治疗提供参考。
[0016]2、本发明样品前处理步骤中，水浴锅中沸水浴10-20分钟，边加热边搅拌，转速控制在150-200r/min，在这一范围内，物料粘度不会随着搅拌的进行而增大，如果转速过高，粘度增大后转速会逐渐降低会影响河豚毒素的溶出。
【附图说明】
[0017]图1是0.2%的醋酸(pH = 3.0)做流动相的河豚毒素标准样液相色谱图。
[0018]图2 是 0.05mol/LNaH2P04-0.05mol/L Na2HP04 (pH = 6.8)以及庚烷磺酸钠离子对5mM做流动相的河豚毒素标准样液相色谱图。
[0019]图3是磷酸做流动相的河豚毒素标准样液相色谱图。
[0020]图4是0.2 %的醋酸(pH = 3.0)做流动相的溶解物液相色谱图。
[0021]图5是以磷酸缓冲液为流动相作为标准液，全波段扫描的紫外光谱图。
[0022]图6是以0.2%的醋酸溶液溶解为流动相作为标准液，全波段扫描的紫外光谱图。
[0023]图7是以0.2%醋酸溶解的河豚毒素标准样，全波段扫描的紫外光谱图。
[0024]图8是以中国鲎的肌肉样品溶液为代表，对抽提的样品进行全波段扫描的紫外光谱图。
[0025]图9是以圆尾鲎的肌肉样品溶液为代表，对抽提的样品进行全波段扫描的紫外光谱图。
[0026]图10是对标准品分别选用194、198、200、204、214nm等5种波长进行色谱检测。
[0027]图11是以磷酸流动相、200nm紫外波长条件下，进行0.2%醋酸和河豚毒素标准样的色谱检测。
[0028]图12是将河豚毒素标准样、中国鲎肌肉、圆尾鲎肌肉色谱图进行比较。
[0029]图13是将河豚毒素标准样、中国鲎黄色结缔组织、圆尾鲎黄色结缔组织色谱图进行比较。
[0030]图14将河豚毒素标准样、中国鲎肌肉、圆尾鲎肌肉色谱图色谱峰的高矮进行比较.
[0031]图15将河豚毒素标准样、中国鲎黄色结缔组织、圆尾鲎黄色结缔组织色谱图进行色谱峰高矮的比较。
【具体实施方式】
:
[0032]下面以实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
[0033]材料与方法
[0034]中国鲎的成鲎购于湛江海鲜批发市场；圆尾鲎成鲎采自湛江东海岛民安海区。
[0035]仪器
[0036]日本岛津EL-120HA电子天平(感量0.0lg)，日本岛津AY120电子天平(感量
0.0OOlg)，天津市津腾实验设备有限公司GM-0.33 II真空隔膜抽滤机，科大创新股份有限公司KDC-160H高度冷冻离心机。日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪，日本岛津STO-20A可见-紫外检测器，SunFire?C18色谱柱(4.6mmX 150mm)，意大利哈纳HI8424 pH计，北京普析通用仪器有限公司TU1901紫外-可见分光光度计。
[0037]试剂
[0038]河豚毒素，经北京毕特博生物有限公司，从美国ENZO公司进口，纯度大于99%。庚烷磺酸钠，冰醋酸、NaH2POjP Na 2ΗΡ04均为分析纯，甲醇为色谱纯，购自湛江林达公司。超纯水自制。
[0039]方法
[0040]标准贮备液的配制
[0041]精密称量TTX 1.0mg置于5ml离心管中，用Iml移液枪吸取1.0mL的醋酸(0.2% )，使其溶解后即得1.0mg/mL的TTX贮备溶液，置于冰箱中保存。
[0042]样品的前处理
[0043]参照周昕等的方法进行改良的河豚毒素抽提法进行样品处理:取中国鲎或圆尾鲎待测组织10g，剪碎后加1ml 0.1%的醋酸(pH = 3.5)于玻璃匀浆器中匀浆。充分匀浆后将样品置于烧瓶中，加50ml醋酸(0.1%)，然后在水浴锅中沸水浴10-20分钟，边加热边搅拌，转速控制在150-200r/min。冷却后用0.45 μ m滤膜真空抽滤，将滤液放入蒸发皿中，在60-70 °C的水浴锅上进行蒸发浓缩，直至10ml，然后过滤定溶至10ml。将浓缩的滤液1ml放在离心管中，经10000r/min的速度，离心15分钟。取上清液经0.22 μ m的微孔滤膜过滤后，放入干净的离心管中，作为液相色谱待测液。中国鲎、圆尾鲎组织共进行2次取样抽提。
[0044]色谱条件
[0045]醋酸流动相色谱