饮片HPLC指纹图谱分析的条件：精密称取天山雪莲破壁 饮片样品（粉末20121104) I. 000g，置具塞锥形瓶中，加入50mL甲醇，超声提取45min，放 冷，过滤，滤液水浴蒸干，加甲醇溶解并定容至l〇ml，0. 22um微孔滤膜过滤得供试品；拟定4 个样品洗脱系统（甲醇-水；乙腈-水；甲醇-水-磷酸；乙腈-水-磷酸）分别洗脱供试 品，色谱柱为 Agilent ZORBAX SB-C18 色谱柱（4. 611111^250臟，5以111)，柱温为25°0,040检 测器，流速为1.0 mL/min，进样量为101，分别在210nm、254nm、280nm和325nm波长下比较4 个洗脱系统的效果，初步筛选出一个较优的洗脱条件（梯度1-22)，作为后期天山雪莲样品 制备方法考察和色谱条件考察的原始色谱条件。
[0032] 2. 2样品提取制备方法研宄考察
[0033] 2. 2. 1提取溶剂的考察
[0034] 由于天山雪莲中的主要活性成分为黄酮及其苷、苯丙素和生物碱，这几类成分在 乙酸乙醋、乙醇和甲醇中的溶解性较好，所以本项考察乙酸乙醋、乙醇和甲醇3种溶剂提取 天山雪莲破壁饮片化学成分的效率。
[0035] 样品处理：精密称取过筛后的天山雪莲破壁饮片样品约I. 000g，3份，置于具塞锥 形瓶中，分别加入①乙醇、②甲醇、③乙酸乙醋各50ml，浸泡30min，超声提取45min，放冷， 过滤，滤液水浴蒸干，加甲醇溶解并定容至l〇ml，0. 22um微孔滤膜过滤即得供试品。
[0036] 色谱条件：采用2. 1项下预试验所筛选出的色谱条件分析3份样品，Agilent ZORBAX SB-C18 色谱柱（4. 6mmX 250mm，5 μ m)，柱温为 30°C，DAD 检测器，流速为 1.0 ml/min， 进样量为10 μ 1，检测波长为270nm、280nm、285nm和325nm。按梯度1-22分析比较不同溶 剂提取差异。结果显示（见图1):甲醇提取样品所得谱图出峰数目多、峰分布均匀且响应 值高，为最佳提取溶剂。
[0037] 2. 2. 2提取溶剂浓度的考察
[0038] 分别考察50%甲醇、70%甲醇、甲醇3种不同浓度提取溶剂对天山雪莲破壁饮片 化学成分提取效率的影响。
[0039] 样品处理：精密称取3份天山雪莲破壁饮片样品约I. 000g，置具塞锥形瓶中，分别 量取50 %甲醇、70 %甲醇和甲醇各50ml，称定重量，浸泡30min，超声提取45min，取出，冷却 后补足失重，摇匀，0. 22 μ m微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品。
[0040] 色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18 色谱柱（4. 6mmX 250mm，5 μ m)，柱温为 30°C， DAD检测器，流速为1.0 mL/min，进样量为10 yL，检测波长为270nm、280nm、285nm和325nm〇 按梯度1-22分析比较不同浓度甲醇提取差异。结果显示：50%甲醇提取物出峰个数少， 70 %甲醇和纯甲醇提取物几乎相同，出峰个数多，70 %甲醇提取物谱图响应值最高、纯甲醇 提取物图谱峰分布均匀。综合考虑最佳提取溶剂为70%甲醇。结果见图2。
[0041] 2. 2. 3浸润时间的考察
[0042] 精密称定4份天山雪莲破壁饮片约1.0 OOg，置具塞锥形瓶中，分别加入50ml70% 甲醇，称定重量，分别静置0min、30min、60min及过夜，超声提取45min，取出，冷却后补足失 重，摇匀，0. 22 μ m微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品。
[0043] 色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18 色谱柱（4. 6mmX 250mm，5 μ m)，柱温为 30°C， DAD检测器，流速为1.0 mL/min，进样量为10 yL，检测波长为270nm、280nm、285nm和325nm， 流动相为甲醇-〇. 3%的磷酸溶液，按梯度1-22分析。分析比较各浸润时间所得主要色谱峰 的情况。结果显示：不同静置时间下的提取样品，峰个数差异不大，所得谱图主要色谱峰面 积相对较大的为浸润60min的样品。表1所不。
[0044] 表1比较浸润时间影响
[0045]
【主权项】
1. 天山雪莲破壁饮片的HPLC指纹图谱共有模式的构建方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 供试品溶液的制备：取天山雪莲破壁饮片约l.OOOg，加入70%甲醇50ml，水浴加 热回流提取45分钟，用70%甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得； (2) 对照品配制：取芦丁对照品，加70%甲醇溶解配制成浓度分别为0.0555mg/ml的 混合对照品溶液； (3) 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以 甲醇为流动相A，以0. 5 %冰醋酸溶液为流动相B，梯度洗脱：0min-60min，流动相A变化 20% -65% ;柱温为40°C ;检测波长为285nm ;流速：1. OmL/min ;进样量：10 μ 1. (4) 按上述供试品、对照品的制备方法及色谱条件对10批以上的天山雪莲破壁饮片样 品进行HPLC分析，得到相应指纹图谱；以芦丁峰为参照峰，计算各指纹图谱中主要色谱峰 的相对保留时间及相对峰面积；输入指纹图谱分析软件，对各批次样品指纹图谱进行相似 度比较，以平均谱图为共有模式，计算相似度，建立天山雪莲破壁饮片指纹图谱共有模式标 准图谱，包括12个特征峰。
2. -种天山雪莲破壁饮片的质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 按权利要求1所述的构建方法中步骤（1)和步骤（2)分别制备待测样品供试品溶 液和对照品溶液，按步骤（3)的色谱条件，精密吸取待测样品、对照品溶液IOuljiAHPLC 色谱仪，测定，记录色谱，即得。 (2) 合格指标的建立及指定图谱、判断方法 供试品色谱中，应呈现12个与天山雪莲破壁饮片HPLC指纹图谱共有模式标准图谱相 对应的特征峰；按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图 谱的相似度不得低于〇. 9 ;以芦丁峰为对照峰，其余11个共有特征峰相对保留时间分别为： 0· 248、0· 313、0· 426、0· 884、0· 908、0· 933、0· 974、1· 111、1· 841、1· 901、2· 054,各峰相对保 留时间RSD彡±5%，为合格。
【专利摘要】本发明涉及天山雪莲破壁饮片的指纹图谱共有模式构建及其质量检测方法。该方法以芦丁为对照，在柱温40℃，检测波长285nm，甲醇为流动相A，0.5％冰醋酸溶液为相B；洗脱梯度：0min-60min，流动相A变化为20％-65％，进样量10ul的色谱条件下，对10批以上的样品进行HPLC分析，建立共有模式标准图谱和判断指标。将同一色谱条件下的待测样品图谱与之比较，检测待测样品的质量。本发明是首次针对天山雪莲破壁饮片建立的HPLC共有模式标准图谱及质量检测方法。该图谱较全面涵盖了天山雪莲饮片主要活性成分的图谱信息，专属性强，检测快速准确；并能有效控制传统饮片、破壁粉体、破壁饮片的整体质量。
【IPC分类】G01N30-02
【公开号】CN104833733
【申请号】CN201510116243
【发明人】徐吉银, 彭丽华, 王慧玲, 成金乐
【申请人】中山市中智药业集团有限公司
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年3月17日