一种检测胞内分枝杆菌的elisa检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学、细胞生物学与微生物学领域。
【背景技术】
[0002]胞内分枝杆菌为典型的非结核分枝杆菌(NTM)成员，属于分枝杆菌属。生长缓慢(培养所需时间4-8周)，广泛分布于自然界，人畜均可感染，该菌侵入人及动物机体内引起的机体免疫学改变，促进迟发型变态反应增强，感染后因排菌而导致易感者感染，造成本病长期流行。另外胞内分枝杆菌感染与肺结核病的临床表现极为相似，容易造成误诊误治。基于目前胞内分枝杆菌感染对国内外公共卫生方面存在极大的潜在威胁，发展和建立特异、灵敏的检测胞内分枝杆菌方法是十分急需、必要的。
[0003]HBHA是分枝杆菌分泌的一种黏附素，它是由致病性分枝杆菌产生的一种糖蛋白，近年来国内外相关研宄表明HBHA基因具备较好的免疫原性和免疫反应性，是一种良好的疫苗研制的候选基因。2006年张旭霞等应用以天然和重组HBHA蛋白进行ELISA方法检测人结核病，结果显示两者都具备良好的检测敏感性和特异性。可以较好的用于结核病的诊断。
[0004]目前胞内分枝杆菌菌种鉴定主要以形态和生理生化特征的综合指标为依据，此方法操作复杂、费时，重复性差，且试验的影响因素较多，有时出现误判。而ELISA检测方法是目前技术较成熟的技术，其具有操作简便、特异性强、价格低廉且无须特殊仪器等优点比较容易大面积推广。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是:提供一种检测胞内分枝杆菌的ELISA检测方法，采用单克隆抗体技术制备胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体，以制备的胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体为包被抗体，建立胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测方法，实现快速、便捷、实时、特异检测胞内分枝杆菌生物学新方法，为人类健康与农牧业发展服务。
[0006]本发明的胞内分枝杆菌ELISA检测方法是: a、胞内分枝杆菌抗血清的制备
(O免疫死菌剂与活菌制剂的制备
免疫死菌剂:胞内分枝杆菌于Middle brook 7H10抗原培养基中培养2~4周(菌处于对数生长期)，用含3%甲醛的无菌生理盐水洗涤一下并收集于小安培瓶中，37 ^于室温静置24h灭活胞内分枝杆菌，旋涡震荡器充分震荡混匀制成菌悬液，再静置lh，吸取沉淀后的上层菌悬液于离心管中，4°C离心机3000r/min~5000r/min离心lOmin，弃去上清液，并在525nm波长下用无菌生理盐水稀释菌体沉淀至OD值为0.3，4°C备用。
[0007]活菌免疫制剂:待Middle brook 7H10抗原培养基上的胞内分枝杆菌处于对数生长期(培养2~4周)，用无菌生理盐水冲洗胞内分枝杆菌并收集于小安培瓶中，于室温下静置24h，旋涡震荡器充分震荡混匀制成菌悬液，再静置lh，吸取沉淀后的上层菌悬液于离心管中，4°C离心机3000r/min~5000r/min离心lOmin，弃去上清液，并在525nm波长下用无菌生理盐水稀释菌体沉淀至OD值为0.3，4°C备用。
[0008](2)胞内分枝杆菌抗血清制备
首先试验用健康无抗兔，共免疫四次，每次免疫相隔一周，第一次、第二次为胞内分枝杆菌死菌剂免疫；第三次和第四次用胞内分枝杆菌活菌制剂。同时设空白对照组，注射生理盐水。四次免疫分别以0.5mL、l.0mLU.0mLU.5mL剂量耳缘静脉注射。末次免疫后一周，对实验动物进行耳缘静脉采血，并做抗体效价检测，当血清凝集效价达到1:160时，颈动脉采血，采集的血液移入灭菌50mL大离心管中，置于37°C培养箱中静置30min后再于4°C冰箱中静置过夜，自然沉降法析出血清，之后4°C离心机中3000r/min~5000r/min离心lOmin，收集上清抗血清，分装于无菌小安培瓶中。-20 °C保存备用。
[0009]b、改良过碘酸钠法制备胞内分枝杆菌抗血清酶标抗体
(I)取5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于0.5mL蒸馏水，加入1%2，4 二硝基氟苯(DNFB)无水乙醇溶液100 μ I,室温下轻微搅拌作用Ih。
[0010](2)加入ImL 0.06mol/L Na14,室温下避光轻搅30min，溶液呈黄绿色。
[0011](3)加入ImL0.16mol/L乙二醇，室温(20°C ± )下轻搅作用I h，终止氧化反应。
[0012](4)加入5mg抗体，装入透析袋，置0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液I 000 mL中，4°C透析过夜，更换3次。
[0013](5)取出透析袋中液体(约3 mL)，加入5mg/mLNaHB4 200 μ L 4°C 2h或过夜。
[0014](6)加50%饱和硫酸铵(NH4)2304溶液6 mL沉淀结合物，置4°C 30min后，3 OOOr/min离心30min，取沉淀。
[0015](7)将沉淀物溶于PBS (0.02M ρΗ7.4)中，装入透析袋，并以此缓冲液透析平衡6~12h，换液3次。
[0016](8)在结合物内加入等量60%甘油，小量分装(或冻干，不需加甘油)，低温保存备用。
[0017]C、胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测方法建立
Cl)抗体包被:100 μ L包被液(pH 9.6,0.05mol/L碳酸盐缓冲液)包被胞内分枝杆菌HBHA单抗隆抗体(终浓度为0.2-0.6 μ g/ml)，4°C包被12~24h或37°C孵育lh~2h，甩掉孔内液体。
[0018](2)封闭:每孔中加入10(^1^封闭液(1°/(^4)轻轻摇匀，4°〇过夜或37°〇lh。甩掉孔内封闭液，逐孔加满洗涤缓冲液(pH 7.4,0.15mol/L PBS)，静置2~3min，甩掉孔内洗涤缓冲液，反复洗涤2~4次后拍干。
[0019](3)加待检样品:每孔加入待检的疑似胞内分枝杆菌检样每孔100yL，37°C温育l~1.5h。弃去菌样，逐孔加满洗涤缓冲液(pH 7.4,0.15mol/L PBS)，静置2~3min，甩掉孔内洗涤缓冲液，反复洗涤2~4次后拍干。每次检测应同时设定空白对照、阳性对照和阴性对照各孔。
[0020](4)加酶标抗体:每孔加入1: 5000~1: 3000稀释的胞内分枝杆菌抗兔IgG-HRP(辣根过氧化物酶标记的胞内分枝杆菌抗兔血清)每孔100 μ L，轻轻摇匀，37°C温育I h，弃去酶标抗体，逐孔加满洗涤缓冲液(pH 7.4,0.15mol/L PBS)，静置2~3min，甩掉孔内洗涤缓冲液，反复洗涤2~4次后拍干。
[0021](5)加显色液:每孔各加入TMB (四甲基联苯胺)显色液100 μ L，，室温避光显色1min?30mino
[0022](6)终止反应:每孔加入50 μ L终止液(2mol/L H2SO4)终止，测OD45tl值，并记录。
[0023](7)判定结果:试验组OD45tl/阴性对照组OD45tl值大于或等于2.1为阳性。
[0024]样品处理:
如检样为液体，取100 μ L检样进行ELISA检测即可。
[0025]如检样为固体动物组织样品，将样品用高压灭菌的生理盐水冲洗三次，去除结缔组织，修切成0.5cmX0.5cm大小方块，加入约ImL生理盐水剪碎或研磨至匀浆。浸泡超过1min,离心取100 μ L上清进行ELISA检测。
[0026]本发明的有益效果是:本发明制备胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体，由于单克隆抗体具备纯度高、特异性强、可以提高各种血清学方法检测抗原的敏感性及特异性的特点，因此以胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体为包被抗体，建立胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测方法，可以提高检测的特异性与敏感性。对胞内分枝杆菌病的诊断和防制具有重要的现实意义，涉及到畜牧业健康发展和国计民生，具有广阔的发展前景和巨大的市场需求。
【附图说明】
[0027]图1是本发明外扩片段的PCR扩增结果图；
图2是本发明内扩片段的PCR扩增结果图；
图3是本发明重组质粒pMD18-T-HBHA的Hind III /BamH I双酶切鉴定图；
图4是本发明测序结果(加入两端酶切位点共646 bp)图；
图5是本发明SDS-PAGE分析图；
图6是本发明表达载体pET32a-HBHA表达产物的Western blot分析图；
图7是本发明HBHA蛋白分离纯化。
【具体实施方式】
[0028]下面结合附图对本发明做进一步描述:
实施例1
图1 中，1.1 HBHA 基因外扩产物；1.2 DL 2000 DNA Marker; 1.3 D 15000 DNAMarker.图 2 中，2.1.DL 2000 DNA Marker; 2.2.HBHA 基因内扩产物；
图 3 中，3.1 DL 2000 DNA Marke; 3.2 DM 10000 Marker; 3.3重组质粒pMD18-T_HBHA的Hind III /BamH I双酶切结果；
图5中，5.1.pET 32a-HBHA诱导前对照；5.2.pET 32a (+)空载体诱导全菌；5.3.pET 32a-HBHA诱导全菌；5.4.蛋白分子量标准；
图6中，6.1预染蛋白分子质量标准；6.2 pET32a_HBHA诱导全菌进行Western blot
分析
图7中，7.1纯化的HBHA蛋白；7.2