一种幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒 及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 幽门螺旋杆菌（HelicobacterPylori，简称HP)是一种生活在人胃黏膜的多鞭 毛、螺旋形的革兰氏阴性细菌。1983年澳大利亚科学家Marshall和Warren首次从慢性活 动性胃炎患者胃粘膜活检标本中成功分离到幽门螺旋杆菌，并因他们在幽门螺旋杆菌研宄 领域做出的贡献，而获得2005年诺贝尔生理学医学奖。幽门螺旋杆菌专性微需氧，生长营 养要求高，且生长缓慢，通常需要3~5天才形成菌落，对低PH比一般细菌有较强耐受力。 HP对胃上皮细胞有特殊的亲和性，自然条件下，大量HP主要出现在胃上皮细胞表面、细胞 间隙及胃小凹中。
[0003] HP感染具有世界范围性，流行病学研宄表明人类对HP易感，HP感染与年龄、地区、 人种、社会经济状况（SES)、卫生状况、人口密集度、饮食习惯等多种因素有关。社会经济状 况越好，GDP越高的国家和地区，HP感染率越低；人口密集程度越大，HP感染率越高。发展 中国家普遍高于发达国家，可达80~90%，发达国家感染率为38~40%;发展中国家儿童 感染率可高达80 %以上，感染的年龄多在3~5岁以前；发达国家相应年龄儿童感染率较 低，不足10%，但随着年龄增长，HP感染呈上升趋势。
[0004] 据报道，世界上超过1/3的人口感染该菌。我国20岁以上的成年人感染率达 32%~75%。关于HP的确切来源和传播途径至今仍不完全清楚。从HP感染的地区流行病 学调查结果显示，粪一口传播的可能性最大。
[0005] 幽门螺旋杆菌具有很强的活性与繁殖能力，是一种严重影响公众健康的细菌。自 从1983年Warren等人首次发现HP以来，HP现已被公认为是上消化道疾病的重要因素。大 量研宄资料表明，HP是慢性活动性胃炎的病原菌，是消化性溃疡的重要致病因子，也是胃粘 膜相关淋巴组织（MALT)淋巴瘤的重要致病因子。研宄人员在对HP与胃癌相关性的研宄中 还发现，感染了HP的人群中患胃癌的比例明显比对照组高，从而提示HP可能是导致胃癌的 致癌因子。在非溃疡性的消化不良患者中，亦有40-70%可检出HP，但两者之间的关系还有 待进一步确证。另一方面，HP的治疗方案复杂，短期效果好，但仍有复发的可能性。因此， 及早诊断HP，对防治上消化道疾病有重要意义。
【发明内容】
[0006] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种幽门螺旋杆菌抗原胶 体金检测试剂盒及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
[0007] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] 本发明的第一方面，提供一种幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒，包括试纸卡， 所述试纸卡包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤 维素膜和吸水垫，所述金标垫上包含胶体金标记的抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-1，所述硝 酸纤维素膜上包被有检测线和质控线。
[0009] 优选的，所述底板为PVC底板。
[0010] 优选的，所述硝酸纤维素膜上，检测线位于离加样端较近一侧，质控线位于离加样 端较远一侧。
[0011] 优选的，所述检测线上包被有抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-2。
[0012] 优选的，所述质控线上包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。
[0013] 所述抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-1和抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-2可以是相同 的单克隆抗体，也可以是不同的单克隆抗体。
[0014] 优选的，所述抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-1为Anti-Helicobacterpylori antibody[51_13] (ab8081)，所述抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体_2为Anti-Helicobacter pyloriantibody[SPM526],prediluted(ab82084)，或所述抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体_1 为Anti-Helicobacterpyloriantibody[SPM526],prediluted(ab82084)，所述抗幽门螺 旋杆菌单克隆抗体 _2 为Anti-Helicobacterpyloriantibody[51-13] (ab8081)〇
[0015] 优选的，所述样品垫采用缓冲液处理，所述缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲 液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，缓冲液 的浓度为50-100mM。
[0016] 优选的，本发明所述的金标垫还经过预处理，预处理时所使用的预处理缓冲液选 自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为 10_40mM〇
[0017] 更优选的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，所述缓冲液还包括 NaCl和冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种 的组合，NaCl在缓冲液中的浓度为0.l-20mg/ml，冠醚在缓冲液中的浓度为0.l-20mg/ml。
[0018] 更优选的，NaCl在缓冲液中的浓度为0. 25-0. 5mg/ml，冠醚在缓冲液中的浓度为 4_8mg/ml〇
[0019] 所述预处理缓冲液的溶剂为水。
[0020] 所述预处理的具体步骤为：将金标垫在预处理液中浸泡1. 5~2h，取出放于36~ 38°C烘干。
[0021] 所述预处理缓冲液可使用本领域各种常用的pH调节剂进行pH值的调节。
[0022] 优选的，所述试剂盒还包括卡壳，所述卡壳包括背卡和上盖，所述背卡设有试纸卡 卡槽，所述试纸卡嵌于所述试纸卡卡槽内，所述上盖设有测试窗和加样孔，所述测试窗的位 置与所述检测线和质控线的位置相配合，所述加样孔的位置与所述样品垫的位置相配合。
[0023] 更优选的，所述卡壳为塑料卡壳。
[0024] 优选的，所述检测试剂盒用于检测样品中的幽门螺旋杆菌抗原，所述样品选自人 粪便。
[0025] 本发明第二方面提供所述幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒的制备方法，包括 如下步骤：
[0026]1)用胶体金标记的抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-1溶液喷涂金标垫，制得包含抗 幽门螺旋杆菌单克隆抗体-1的金标垫；
[0027] 2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-2 及羊抗鼠IgG多克隆抗体，制得包被后的硝酸纤维素膜；
[0028] 3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴 在底板上，切裁制得检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。
[0029] 优选的，本发明所述的金标垫还经过预处理，预处理时所使用的预处理缓冲液选 自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为 10_40mM〇
[0030] 更优选的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，所述缓冲液还包括 NaCl和冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种 的组合，NaCl在缓冲液中的浓度为0.l-20mg/ml，冠醚在缓冲液中的浓度为0.l-20mg/ml。
[0031] 更优选的，NaCl在缓冲液中的浓度为0. 25-0. 5mg/ml，冠醚在缓冲液中的浓度为 4_8mg/ml〇
[0032] 所述预处理缓冲液的溶剂为水。
[0033] 所述预处理的具体步骤为：将金标垫在预处理液中浸泡1. 5~2h，取出放于36~ 38°C烘干。
[0034] 所述预处理缓冲液可使用本领域各种常用的pH调节剂进行pH值的调节。
[0035] 本发明第三方面提供所述幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒在幽门螺旋杆菌 抗原检测领域的用途。
[0036] 本发明的有益效果为：
[0037] 本发明所提供的幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒兼具高灵敏性和高特异性， 能够快速检测幽门螺旋杆菌抗原。此外，所述检测试剂盒具有操作快速简便、结果准确、经 济适用等优点。
【具体实施方式】
[0038] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0039] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"这个"包括复数形式。
[0040] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0041] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook 等MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarbor LaboratoryPress，1989andThirdedition，2001;Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSIN MOLECULARBIOLOGY,Johnffiley&Sons,NewYork,1987andperiodicupdates；theseries METHODSINENZYMOLOGY,AcademicPress,SanDiego；ffolffe,CHROMATINSTRUCTUREAND FUNCTION,Thirdedition,AcademicPress,SanDiego,1998 ；METH0DSINENZYMOLOGY, Vol. 304,Chromatin(P.M.ffassarmanandA.P.ffolffe,eds.),Academ