一种庆大霉素的磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种化学发光检测试剂盒及其检测方法。特别是检测牛奶、奶粉等样 品中庆大霉素残留量的磁免疫化学发光检测试剂盒。属于免疫学检测领域。
【背景技术】
[0002] 庆大霉素（Gentamicin)是由小单胞菌发酵产生的一种氨基糖苷类抗生素。广泛 应于质量革兰氏阴性菌引起的感染。庆大霉素抗菌谱较广，可以有效抑制细菌的生长和繁 殖，是目前中国农业、畜牧业和水产业常用的兽药之一。但是随着庆大霉素的广泛使用，一 些细菌逐渐对其产生了耐药性，而且对脑神经、听觉以及肾脏的损害严重，随着该药物的大 量使用，其残留检测也渐渐被人们所重视。我国及欧盟对庆大霉素的残留有严格要求，在牛 奶中的最大残留限量不能高于1〇〇yg/kg。
[0003] 庆大霉素残留量常用的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC)、气相色谱法 (GC)、高效液相色谱质谱串联法（HPLC-MS/MS)、液相色谱-质谱联用技术（LC-MS)、薄层色 谱法（TLC)、免疫测定法等。由于昂贵的仪器设备和复杂繁琐的操作过程，以及对检验人员 的高技能要求，使得上述仪器检测方法不适合大量样品的筛查。酶联免疫检测法和胶体金 免疫层析检测法虽然属于快速筛检方法，但由于方法灵敏度较低，假阴性率和假阳性率较 高，逐渐被灵敏度高、准确度高、检测时间短的化学发光免疫检测方法所替代，磁免疫化学 发光免疫检测试剂配套磁免疫化学发光检测仪检测食品中庆大霉素的残留，实现检测过程 的全自动化，减少人为操作误差，灵敏度可达到〇. 1yg/L，准确度高，检测成本低，适用于大 批量样品中庆大霉素残留量的筛查。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题自在于提供一种庆大霉素检测试剂盒，采用该试剂盒 进行庆大霉素的检测时具有较高的灵敏度、特异性和准确度。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供一种庆大霉素的检测方法，采用该试剂盒配合化学 发光检测仪进行庆大霉素的检测时不仅具有较高的灵敏度、特异性和准确度，而且实现了 全自动化检测，缩短检测时间，减少人为操作误差。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供一种庆大霉素检测试剂盒，其包含的主要试剂有：酶 标抗原、酶标抗原稀释液、磁标抗体、磁标抗体稀释液、庆大霉素系列标准品溶液、化学发光 底物A、B液。
[0007] 所述的酶标抗原是辣根过氧化物酶标记的庆大霉素半抗原的标记物，庆大霉素半 抗原是用重铬酸吡啶将庆大霉素原药中的醇羟基氧化成酮基，得到单酮基庆大霉素，然后 单酮基庆大霉素与对甲酸苯肼进行缩合反应，得到带有羧基的庆大霉素半抗原产物。
[0008] 所述磁标抗体是庆大霉素单克隆抗体与磁珠偶联得到。
[0009] 所述磁珠表面含有-0H、-C00H或_順2活性基团。
[0010] 所述庆大霉素单克隆抗体是由庆大霉素半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作 为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。
[0011] 所述化学发光底物A液为含有鲁米诺和对甲苯酚的三羟甲基氨基甲烷的溶液。化 学发光液B液为含有柠檬酸、无水Na2HP0jPC0(NH2) 2 ?H202的水溶液。
[0012] 所述试剂盒还包括标准品溶液、浓缩复溶液和浓缩洗涤液。
[0013] 所述试剂盒可以配套化学发光检测仪进行动物源性样品中庆大霉素残留量的检 测。
[0014] 本发明还提供一种利用试剂盒配套化学发光仪检测庆大霉素的方法，包括下列步 骤：
[0015] 1)将酶标抗原与酶标抗原稀释液按照1:10~1:20的体积比进行稀释，装入化学 发光检测仪酶标抗原工作液容器中；
[0016] 2)将磁标抗体与磁标抗体稀释液按照1:10~1:20的体积比进行稀释，装入化学 发光检测仪磁标抗体工作液容器中；
[0017] 3)化学发光检测仪自分别动吸取30yL~80yL酶标抗原、30yL~80yL样品 提取液和30yL~80yL磁标抗体，依次加入到反应区，在室温下反应15min，在磁分离区分 离4min，弃上清液后用洗涤液300yL~500yL对复合物沉淀清洗3~5次；
[0018] 4)将分离好的复合物放入测量暗箱，加入化学发光底物A液和B液各30yL~ 80yL，检测发出的相对光强度（RLU)，样品中庆大霉素的含量与RLU成一定比例关系，可以 通过RLU标准曲线计算庆大霉素的残留浓度。
[0019] 本发明中分析测试方法所用的化学发光检测仪包括电源电路、反应杯存储装置、 样品存储装置、样品臂、试剂存储装置、试剂臂、运动式冷藏装置、清洗装置、自动注射泵、微 光检测器，同时还配置有计算机与中文界面的Windows控制软件，可进行资料录入、结果汇 总、质量控制、结果存储和结果查询等功能，可完成多种分析模式的编程，定量或定性报告 结果，自动生成并储存和更新功能，两点自动修正标准曲线。
[0020] 本发明所述的酶标抗原是辣根过氧化物酶标记的庆大霉素半抗原的标记物，其保 存于含？耵.2~7.6，含吐温0.03%~0.05%吐温-20,0.02111〇1/1~0.05111〇1/1的磷酸盐 缓冲液中。所述百分含量是质量百分含量。
[0021] 所述酶标抗原稀释液是pH7. 2~pH7. 6、Na3P04浓度为0? 01mol/L、NaCl浓度为 0? 25mol/L的缓冲溶液。
[0022] 所述磁标抗体是庆大霉素单克隆抗体与磁珠偶联得到。磁珠表面基团的含量是 0?leq/g~0? 3eq/g，所述磁标抗体保存在pH7. 2~7. 6,含吐温0? 1 %~0? 3 %吐温-20， 0. 02mol/L~0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液中。所述百分含量是质量百分含量。
[0023] 所述磁标抗体稀释液是pH7. 2~pH7. 6、Na3P04浓度为0? 02mol/L、NaCl浓度为 0? 3mol/L的缓冲溶液。
[0024] 所述庆大霉素单克隆抗体通过庆大霉素半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作 为免疫原免疫Balb/c小鼠、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选、亚克隆和小鼠腹水的效价测定 得到。
[0025] 所述化学发光底物A液为鲁米诺含量为0. 01yg/L~0. 03yg/L、对甲苯酷含量 为0? 001yg/L~0? 005yg/L、pH为8. 0~9. 0的三轻甲基氨基甲烧溶液，B液为每100mL 水溶液含柠檬酸1.7§~2.3§，无水似2即0 42.2§~3.(^和体积百分含量为0.75%的 C0(NH2) 2 ?H2020. 5mL~0? 8mL。
[0026] 所述庆大霉素标准品溶液浓度分别为：0 yg/L、0. 1yg/L、0. 3yg/L、0. 6yg/L、 1.8 1^/1、5.41^/1，标准品稀释液为口117.4，含0.05%吐温-20,0.05111〇1/1的磷酸盐缓冲 液。所述百分含量是质量百分含量。
[0027] 所述浓缩复溶液具体为浓缩磷酸盐缓冲液，是每升含4. 0g~7. 0g的 NaH2P04 ? 2H20、30. 0g~33. 0gNa2HP04 ? 12H20 的水溶液。
[0028] 所述浓缩洗涤溶液是含有体积分数0? 02 %~0? 06 %吐温-20的pH= 7. 4~7. 6， 0? 2mol/L~0? 5mol/L磷酸盐缓冲液。
[0029] 本发明的有益效果如下：
[0030] 1)本发明试剂盒的具有较高的灵敏度和特异性，对庆大霉素的检测灵敏度可达到 0. 3yg/L〇
[0031] 2)本发明试剂盒配套化学发光检测仪对样品中庆大霉素残留量进行检测，实现检 测过程的全自动化，减少人为操作误差，检测时间短，仅需20min即可完成对样品中庆大霉 素残留量的检测。
【附图说明】
[0032] 图1为庆大霉素半抗原合成反应式。
[0033] 图2为庆大霉素半抗原核磁共振氢谱图。
[0034] 图3为本发明磁免疫化学发光检测试剂盒标准曲线。
【具体实施方式】
[0035] 实施例1:试剂盒具体组分的制备
[0036] 1.庆大霉素半抗原合成
[0037] 庆大霉素半抗原是用重铬酸吡啶将庆大霉素原药中的醇羟基氧化成酮基，得到单 酮基庆大霉素，然后单酮基庆大霉素与对甲酸苯肼进行缩合反应，得到带有羧基的庆大霉 素半抗原产物。取〇. 6g~1. 2g庆大霉素加入到N，N_二甲基甲酰胺中溶解，再加入0. 80g~ 0. 85g重铬酸吡啶，搅拌，加入0.lmL~0. 5mL乙酸，60°C油浴加热搅拌6h，待反应完全，停 止反应并蒸干，加水和乙酸乙酯萃取，干燥，乙醇重结晶，得到产物1。取产物1加甲醇溶解， 再加0.lg~0. 6gK2C03，搅拌，向其中加入0. 2g~0. 7g甲酸苯肼，在室温下搅拌8h，待有 沉淀物析出离心分离，用乙醇洗涤，再加乙酸乙酯重结晶得到庆大霉素半抗原产物0. 3g~ 0. 6g。合成反应式如图1所示。
[0038] 取上述庆大霉素半抗原产物经核磁氢谱测定，如图2所示，化学位移S=llppm 的位置为羧基氢共振吸收峰，化学位移S=7. 8、6.8ppm的位置为苯环上的氢共振吸收峰， 证明间隔臂连接成功，庆大霉素半抗原合成成功。
[0039] 2?酶标抗原的制备
[0040] 取18mg~25mg庆大霉素半抗原，溶解于0? 8mL~1. 2mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF) 中；取25mg~30mg二氯乙烷（EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)用0?lmL~0? 3mL水充 分溶解后加入半抗原溶解液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A;称取辣根过氧化物酶 (HRP) 40mg~55mg，使之充分溶解在pH7. 2, 3. 8mL的磷酸盐缓冲液中，将反应液A逐滴缓慢 滴加到HRP溶液中，并于室温下搅拌24h;用0.Olmol/L的磷酸盐缓冲液于4°C透析3天，每 天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到庆大霉素酶标抗原；分装，于-20°C保存 备用。
[0041] 3.免疫原的制备
[0042] 将HRP30mg~70mg替换为牛血清白蛋白（BSA)40mg~60mg，制备方法同上，得到 免疫原。
[0043] 4.庆大霉素单克隆抗体的制备
[0044]A)动物免疫：用上述制备出的免疫原（RAC-BSA)按100yg/只，以生理盐水溶解 免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Balb/c雌鼠，初次免 疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以 免疫复合物100Ug/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。
[0045]B)细胞融合：按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨 髓瘤细胞（SP2/0)混合，然后在45秒内缓慢加入预热的融合剂（PEG4000)进行融合，用HAT 培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37°C，5 %C02培养箱中培 养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。
[0046]C)杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛 选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原（预先用方阵法常规滴定其 最佳包被浓度和阳性血清稀释度）包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗