一种林可霉素的磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种化学发光检测试剂盒及其检测方法。特别是检测牛奶、奶粉等样 品中林可霉素残留量的磁免疫化学发光检测试剂盒。属于免疫学检测领域。
【背景技术】
[0002] 林可霉素（LinC〇mycin，LIN)又称洁霉素，是由林肯链霉菌发酵产生的林可酰胺 类抗生素。林可霉素具有较强的抑菌活性，主要作用于革兰氏阳性细菌，是一个RNA依赖的 乙酰胆碱酯酶抑制剂。林可霉素作为饲料添加剂，有提高增重速率、改善饲料报酬的功效。 使用方法主要是添加林可霉素制品混合于饲料中使用，或采用直接注入患病乳牛乳房治疗 奶牛乳房炎，两种给药方式都会造成药物在牛乳中残留。据文献报道对奶牛乳房灌注给药 以后，其排泄主要经乳腺随乳汁排出，可能导致在牛奶产品中相当水平的药物残留。我国食 品卫生法规定，在应用抗生素期间和停药后5天内的乳不能食用，牛奶中残留的抗生素会 危害饮用者身体健康。因此，各国对其残留均作出限量要求。欧盟和中国农业部235号文件 规定食品中林可霉素最大残留限量：牛奶中150yg/L，肌肉中100yg/kg，肝脏中500yg/ kg〇
[0003] 林可霉素残留量常用的检测方法主要有微生物法、高效液相色谱法（HPLC)、气相 色谱法（GC)、高效液相色谱质谱串联法（HPLC-MS/MS)、液相色谱-质谱联用技术（LC-MS)、 氮磷气相色谱检测法、薄层色谱法（TLC)、免疫测定法等。由于昂贵的仪器设备和复杂繁琐 的操作过程，以及对检验人员的高技能要求，使得上述仪器检测方法不适合大量样品的筛 查。酶联免疫检测法和胶体金免疫层析检测法虽然属于快速筛检方法，但由于方法灵敏度 较低，假阴性率和假阳性率较高，逐渐被灵敏度高、准确度高、检测时间短的化学发光免疫 检测方法所替代，磁免疫化学发光免疫检测试剂配套磁免疫化学发光检测仪检测食品中林 可霉素的残留，实现检测过程的全自动化，减少人为操作误差，灵敏度可达到〇. 3yg/L，准 确度高，检测成本低，适用于大批量样品中林可霉素残留量的筛查。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题自在于提供一种林可霉素检测试剂盒，采用该试剂盒 进行林可霉素的检测时具有较高的灵敏度、特异性和准确度。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供一种林可霉素的检测方法，采用该试剂盒配合化学 发光检测仪进行林可霉素的检测时不仅具有较高的灵敏度、特异性和准确度，而且实现了 全自动化检测，缩短检测时间，减少人为操作误差。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供一种林可霉素检测试剂盒，其包含的主要试剂有：酶 标抗原、酶标抗原稀释液、磁标抗体、磁标抗体稀释液、林可霉素系列标准品溶液、化学发 光底物A、B液。
[0007] 所述的酶标抗原是辣根过氧化物酶标记的林可霉素半抗原的标记物，林可霉素半 抗原是由林可霉素中的醇羟基经重铬酸吡啶氧化后得到酮基林可霉素，酮基林可霉素再与 氨基丁酸进行缩合反应，得到四碳链羧基半抗原。
[0008] 所述磁标抗体是林可霉素单克隆抗体与磁珠偶联得到。
[0009] 所述磁珠表面含有-0H、-C00H或_順2活性基团。
[0010] 所述林可霉素单克隆抗体是由林可霉素半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作 为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。
[0011] 所述化学发光底物A液为含有鲁米诺和对甲苯酚的三羟甲基氨基甲烷的溶液。化 学发光液B液为含有柠檬酸、无水Na2HP0jPC0(NH2)2 ?H202的水溶液。
[0012] 所述试剂盒还包括标准品溶液、浓缩复溶液和浓缩洗涤液。
[0013] 所述试剂盒可以配套化学发光检测仪进行动物源性样品中林可霉素残留量的检 测。
[0014] 本发明还提供一种利用试剂盒配套化学发光仪检测林可霉素的方法，包括下列步 骤：
[0015] 1)将酶标抗原与酶标抗原稀释液按照1:10~1:20的体积比进行稀释，装入化学 发光检测仪酶标抗原工作液容器中；
[0016] 2)将磁标抗体与磁标抗体稀释液按照1:10~1:20的体积比进行稀释，装入化学 发光检测仪磁标抗体工作液容器中；
[0017] 3)化学发光检测仪自分别动吸取30yL~80yL酶标抗原、30yL~80yL样品 提取液和30yL~80yL磁标抗体，依次加入到反应区，在室温下反应15min，在磁分离区分 离4min，弃上清液后用洗涤液300yL~500yL对复合物沉淀清洗3~5次；
[0018] 4)将分离好的复合物放入测量暗箱，加入化学发光底物A液和B液各30yL~ 80yL，检测发出的相对光强度（RLU)，样品中林可霉素的含量与RLU成一定比例关系，可以 通过RLU标准曲线计算林可霉素的残留浓度。
[0019] 本发明中分析测试方法所用的化学发光检测仪包括电源电路、反应杯存储装置、 样品存储装置、样品臂、试剂存储装置、试剂臂、运动式冷藏装置、清洗装置、自动注射泵、微 光检测器，同时还配置有计算机与中文界面的Windows控制软件，可进行资料录入、结果汇 总、质量控制、结果存储和结果查询等功能，可完成多种分析模式的编程，定量或定性报告 结果，自动生成并储存和更新功能，两点自动修正标准曲线。
[0020] 本发明所述的酶标抗原是辣根过氧化物酶标记的林可霉素半抗原的标记物，其保 存于含？耵.2~7.6，含吐温0.03%~0.05%吐温-20,0.02111〇1/1~0.05111〇1/1的磷酸盐 缓冲液中。所述百分含量是质量百分含量。
[0021] 所述酶标抗原稀释液是pH7. 2~pH7. 6、Na3P04浓度为0? 01mol/L、NaCl浓度为 0? 25mol/L的缓冲溶液。
[0022] 所述磁标抗体是林可霉素单克隆抗体与磁珠偶联得到。磁珠表面基团的含量是 0?leq/g~0? 3eq/g，所述磁标抗体保存在pH7. 2~7. 6,含吐温0? 1 %~0? 3 %吐温-20， 0. 02mol/L~0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液中。所述百分含量是质量百分含量。
[0023] 所述磁标抗体稀释液是pH7. 2~pH7. 6、Na3P04&度为0? 01mol/L、NaCl浓度为 0? 25mol/L的缓冲溶液。
[0024] 所述林可霉素单克隆抗体通过林可霉素半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作 为免疫原免疫Balb/c小鼠、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选、亚克隆和小鼠腹水的效价测定 得到。
[0025] 所述化学发光底物A液为鲁米诺含量为0. 01yg/L~0. 03yg/L、对甲苯酚含量 为0? 001yg/L~0? 005yg/L、pH为8. 0~9. 0的三轻甲基氨基甲烧溶液，B液为每100mL 水溶液含柠檬酸1.7§~2.3§，无水似2即0 42.2§~3.(^和体积百分含量为0.75%的 C0(NH2)2 ?H2020. 5mL~0? 8mL〇
[0026] 所述林可霉素标准品溶液浓度分别为：0yg/L、0. 3yg/L、0. 9yg/L、l. 8yg/L、 5.41^/1、10.8 1^/1，标准品稀释液为口117.4，含0.05%吐温-20,0.05111〇1/1的磷酸盐缓冲 液。所述百分含量是质量百分含量。
[0027] 所述浓缩复溶液具体为浓缩磷酸盐缓冲液，是每升含5.Og~8.Og的 NaH2P04 ? 2H20、30. 0g~35. 0gNa2HP04 ? 12H20 的水溶液。
[0028] 所述浓缩洗涤溶液是含有体积分数0? 03 %~0? 08 %吐温-20的pH= 7. 4~7. 6， 0.lmol/L~0. 7mol/L磷酸盐缓冲液。
[0029] 本发明的有益效果如下：
[0030] 1)本发明试剂盒的具有较高的灵敏度和特异性，对林可霉素的检测灵敏度可达到 0. 3yg/L〇
[0031] 2)本发明试剂盒配套化学发光检测仪对样品中林可霉素残留量进行检测，实现检 测过程的全自动化，减少人为操作误差，检测时间短，仅需20min即可完成对样品中林可霉 素残留量的检测。
【附图说明】
[0032] 图1为林可霉素半抗原合成反应式。
[0033] 图2为林可霉素半抗原核磁共振氢谱图。
[0034] 图3为本发明磁免疫化学发光检测试剂盒标准曲线。
【具体实施方式】
[0035] 实施例1 :试剂盒具体组分的制备
[0036] L林可霉素半抗原合成
[0037] 林可霉素半抗原是由林可霉素中的醇羟基经重铬酸吡啶氧化后得到酮基林可霉 素，酮基林可霉素再与氨基丁酸进行缩合反应，得到四碳链羧基半抗原。取〇. 8g~1. 2g林 可霉素加入到乙腈中溶解，再加入0. 80g~0. 85g重铬酸吡啶，搅拌，加入0. 5mL~1.lmL 乙酸酐和〇. 3mL~0. 7mL乙酸，室温搅拌6h，待反应完全，停止反应并蒸干，上硅胶柱纯化， 乙酸乙酯：石油醚=1:1洗脱分离，得到产物1。取产物1加甲醇溶解，再加含1. 〇g~1. 4g 氨基丁酸的水溶液2mL~4mL和0. 5g~0. 8g氢氧化钾的水溶液2mL，于60°C加热反应7h， 反应完全，停止反应，旋蒸，加水，调节pH值至6,加乙酸乙酯萃取，蒸干，得到无色油状物， 再加乙醇重结晶得到林可霉素半抗原产物0. 4g~0. 6g。合成反应式如图1所示。
[0038] 取上述林可霉素半抗原产物经核磁氢谱测定，如图2所示，化学位移S=llppm 的位置为羧基氢共振吸收峰，化学位移S=2.3、1.6、1.3ppm的位置为间隔臂上亚甲基的 氢共振吸收峰，证明间隔臂连接成功，林可霉素半抗原合成成功。
[0039] 2?酶标抗原的制备
[0040] 取lOmg~15mg林可霉素半抗原，溶解于lmL~1. 5mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF) 中；取27mg~32mg二氯乙烷（EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)用0?lmL~0? 3mL水充分 溶解后于加入半抗原溶解液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A;称取辣根过氧化物酶 (HRP) 30mg~50mg，使之充分溶解在pH7. 2, 3. 8mL的磷酸盐缓冲液中，将反应液A逐滴缓慢 滴加到HRP溶液中，并于室温下搅拌24h;用0.Olmol/L的磷酸盐缓冲液于4°C透析3天，每 天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到林可霉素酶标抗原；分装，于-20°C保存 备用。
[0041] 3.免疫原的制备
[0042] 将HRP30mg~50mg替换为牛血清白蛋白（BSA)40mg~60mg，制备方法同上，得到 免疫原。
[0043] 4.林可霉素单克隆抗体的制备
[0044] A)动物免疫：用上述制备出的免疫原（RAC-BSA)按100yg/只，以生理盐水溶解 免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Balb/c雌鼠，初次免 疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以 免疫复合物100Ug/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。
[0045] B)细胞融合：按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨 髓瘤细胞（SP2/0)混合，然后在45秒内缓慢加入预热的融合剂（PEG4000)进行融合，用 HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37°C，5 %C02培养箱 中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。
[0046] C)杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后，待细胞长