一种裂殖壶菌藻粉中dha含量的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明是一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法，具体涉及裂殖壶菌中不饱和 脂肪酸DHA的定量测定，属于不饱和脂肪酸的检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 脂肪酸是细胞的重要组成部分，不仅为细胞活动提供能量，含有3~5个双建的多 不饱和脂肪酸还是前列腺素和白细胞三烯的合成前体，据研宄表明，α -亚麻酸、二十碳五 烯酸（ΕΡΑ)、二十二碳六烯酸（DHA)等η-3多不饱和脂肪酸还具有抗发炎、抗血栓、抗心律失 常、降血脂和软化血管等作用。η-3多不饱和脂肪酸的主要来源有植物油，例如：例如：菠 菜、马齿苋、亚麻的种子、亚麻仁以及胡桃等，其中以亚麻籽油中含α-亚麻酸（高达57%) 最多，其次是菜籽油、大豆油和小麦胚芽油（7%~13%);其他来源包括一些坚果、种子、 蔬菜和水果、蛋黄、禽肉，其中，鱼类是主要的EPA和DHA来源；除此之外，海洋微生物以及 一些藻类植物也是多不饱和脂肪酸的良好来源，裂殖壶菌即是其中一种。
[0003] 裂殖壶菌（Schizochytrium)作为一类藻类的海洋真菌，该菌易培养、生长快，已实 现工业化生产，其细胞内积累了大量的油脂，90%以上油脂以人体易吸收的甘油三脂（TG) 形式存在，不饱和脂肪酸含量很高，主要为DHA，其它多不饱和脂肪酸含量很低。毒性3+试 验证明使用裂殖壶菌作为食品添加剂饲喂大鼠、兔和猪是安全可靠的，其安全性已得到美 国FDA的认可。目前，壶菌藻粉作为一种理想的DHA新生资源，已广泛应用于食品、药品 和保健品。国内外公开报道裂殖壶菌藻粉文献较多，大多集中在裂殖壶菌的工业化生产、油 脂提取、营养成分分析等，如《裂殖壶菌DHA提取方法的优化和工业化应用》（南京科技大 学，硕士论文，dingweicui，2012. 05)记载的对微生物油脂的提取方法，和《富含DHA的裂殖 壶菌的工业化生产试验、脂肪酸提取及应用研宄》（中国海洋大学，博士学位论文，宋晓金， 2008. 06. 01)记载的工业化生产及脂肪酸的提取技术，但关于裂殖壶菌藻粉中DHA的定量 测定，尚未见公开报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法，该测定方法是 对裂殖壶菌藻粉中提取的油脂进行的气相色谱检测，使用气相色谱内标法定量测定油脂中 的脂肪酸含量，具有样品处理简单，操作简便、快速的特性，测定结果重现性好、可行度高， 并为裂殖壶菌藻粉DHA的质量控制提供了检测方法依据。
[0005] 本发明通过下述技术方案实现：一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法，所述 的测定方法包括以下步骤： A :备样，取标准溶液和裂殖壶菌藻粉样品，在裂殖壶菌藻粉样品中加入内标物和盐酸， 混合后提取油脂，所述的内标物为十三烷酸内标溶液，所述的标准溶液选用Supelco 37种 脂肪酸甲酯混合标准溶液，其浓度为10 mg/mL ; B :制备供试品溶液，将步骤A提取的油脂依次皂化、甲酯化后制得脂肪酸甲酯溶液，在 脂肪酸甲酯溶液中加入异辛烷和饱和NaCl溶液，经混合、静置分层后，移取上层清液，脱水 后制得供试品溶液，备用； C :测定，分别移取等量的供试品溶液和标准溶液I y L，注入气相色谱仪中进行测定， 测定条件包括： 色谱柱：石英毛细管柱， 柱温：60~240°C， 检测器：氢火焰离子化检测器，检测器温度：250~270°C， 汽化室温度：240~260 °C ; 气体流量：载气为高纯氮，流速〇. 8~I. 2mL/min，空气流速300~400mL/min，氢气流 速 30 ~40mT,/min , 分流比：（5~20) :1。
[0006] 本发明方法操作简便、快速、重复性好，适合于批量裂殖壶菌藻粉样品脂肪酸的定 量测定。裂殖壶菌藻粉样品中的油脂提取后，经皂化、甲酯化后衍生为相应的脂肪酸甲酯， 制备成供试品溶液后，以石英毛细管柱分离，氢火焰离子化检测器测定，以样品峰的保留时 间与脂肪酸甲酯标准品的保留时间定性，按内标法计算各脂肪酸的含量，测定结果表明，在 本发明涉及的色谱条件下，37种脂肪酸甲酯在65 min内均获得较好的分离。
[0007] 在本发明中，内标物选用浓度为10. 0 mg/mL的十三烷酸内标溶液，具有测定结果 重现性好、可信度高等良好的使用效果，当然，为提高内标物的使用效果，在所述的步骤A 中，所述盐酸的浓度为4 mol/L，所述裂殖壶菌藻粉样品、内标物、盐酸的质量比为（0. 2~ 0.8) :(4 ~6) :(4 ~6)〇
[0008] 在所述的步骤A中，油脂的提取包括： A. 1 :将裂殖壶菌藻粉样品、内标物、盐酸的混合物依次进行恒温振荡、沸水浴加热和速 冷降温后，制得样品溶液，盐酸浓度为4mol/mL，通常使用漩涡混匀Imin后，再送至水槽进 行恒温振荡； A. 2 :在步骤A. 1制得的样品溶液中加入体积比为1:1的二氯甲烧一甲醇混合溶剂，混 合均匀后进行离心操作，取氯仿层备用； A. 2 :在步骤A. 2制得的氯仿层加入等体积的0. 1%氯化钠溶液，混合均匀后进行离心操 作，取氯仿层，移至干燥瓶中旋转蒸发，蒸发后得到油脂。
[0009] 在所述的步骤A. 1中，恒温振荡时，温度控制在50~70°C，振荡30~50min，振荡 频率80~120次/min ;沸水浴的加热时间为4~6min ;使用-10~-30°C的温度进行速冷 降温。
[0010] 所述离心操作的时间控制在8~12次/min，转速控制在4000~6000r/min。
[0011] 在所述的步骤B中，脂肪酸甲酯溶液的制备包括： B. 1 :皂化，在步骤A提取的油脂中加入0. 5 mol/L的氢氧化钾一甲醇，充N2，水浴加热 并回流； B. 2 :甲酯化：回流8~12min后，加入13~15%的三氟化硼-甲醇，水浴加热并回流 15~30min后，制得脂肪酸甲酯溶液。
[0012] 皂化反应方式式如下：
甲酯化反应方程式如下：
制得的脂肪酸甲酯溶液为二十二碳六烯酸甲酯，其结构式为：
在所述的步骤B中，异辛烷加入沸腾的脂肪酸甲酯溶液中，停止加热后，再加入饱和 NaCl溶液，脂肪酸甲酯溶液、异辛烷、饱和NaCl溶液的质量比为（40~60) : (40~60): (15~30)，加入异辛烷的目的是：异辛烷作为弱极性溶剂，经过涡旋混合，待测的二十二碳 六烯酸甲酯（DHA)全部从KOH-三氟化硼-甲醇混合溶液中转移到异辛烷中；加入饱和NaCl 溶液目的是：为了使异辛烷溶液与KOH-三氟化硼-甲醇-水混合溶液完全分层，在实现上 述过程时，脂肪酸甲酯溶液、异辛烷、饱和NaCl溶液的使用量应按照上述质量比范围严格 操作，才能保证操作过程的顺利进行。
[0013] 在所述的步骤C中，气相色谱仪的测定条件中，色谱柱的初始温度为60 °C，以4 °C/ min升至160 °C后，再以2 °C/ min升至240 °C，其目的是：通过程序升温，保证裂殖 壶菌藻粉脂肪酸分离度完全满足定量测定需要。
[0014] 进一步的，所述气相色谱仪的测定条件中： 色谱柱为 Supelco SP?-2560 石英毛细管柱，100 mXO. 25 mm i.d. X0. 20 μπι; 检测器为氢火焰离子化检测器，检测器温度为260°C ; 汽化室温度：250 °C ; 气体流量：载气为高纯氮，流速1.0 mL/min，空气流速350mL/min，氢气流速35mL/min ; 柱流速：1. O mL/min ; 尾吹流速：40 mL/min ; 分流比：1〇 :1。
[0015] 本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果： (1)本发明是以十三烷酸为内标物，采用气相色谱定量测定裂殖壶菌藻粉中的脂肪酸 (DHA)的检测方法，测定结果以样品峰的保留时间与脂肪酸甲酯标准品的保留时间定性，并 按内标法计算各脂肪酸的含量，具有样品处理简单，操作简便、快速的特性，测定结果重现 性好、可行度高，并为裂殖壶菌藻粉DHA的质量控制提供了检测方法依据。
[0016] (2)本发明选择十三烷酸作为内标物，十三烷酸（CH3(CH2)11C02H，分子量214. 34 )是一种直链脂肪酸，其结构与裂殖壶菌藻粉中C16:0、C22:6 (DHA)相似，且在所选定的 色谱条件下，十三烷酸与C16:0、C22:6得到完全分离，且商品化的十三烷酸纯度可达98% 以上；另一方面，在裂殖壶菌藻粉油脂提取过程就加入十三烷酸作为内标，可保证内标物与 DHA完成同样的前处理过程，即酸热法提取-皂化-甲酯化，从而保证DHA测定结果的准确 性。
[0017] (3)本发明使用酸热法对裂殖壶菌藻粉中的油脂进行提取，利用盐酸的加入，保证 了裂殖壶菌藻粉样品溶液在水浴中振荡后，使原来结构紧密的细胞壁变得疏松，再经沸水 浴及速冻降温处理后，使细胞壁进一步的被破坏，有利于细胞壁中糖、蛋白质、油脂等成分 的析出，再用极性较强的三氯甲烷-甲醇混合溶剂进一步有效地浸提出裂殖壶菌藻粉细胞 中的油脂，操作简单、快速。