[0018] (4)本发明在对油脂进行皂化、甲酯化反应的过程中，需要在反应容器中充入N2, 目的是保护脂肪酸，避免氧气进入，保证皂化、甲酯化反应的正常进行，队冲入时要保证把 反应容器中的空气全部排出，替换为N2，充入时间大概持续I min，反应容器连接冷凝器，便 于水浴加热过程中的蒸发的试剂回流。
[0019] (5)本发明使用的色谱柱为石英毛细管柱，如：SP?-2560毛细管柱，可最大限度分 离裂殖壶菌藻粉脂肪酸及其异构体，从而保证DHA测定结果的准确性，测定结果表明，本发 明方法对37种脂肪酸甲酯在65 min内均获得较好的分离。
[0020] (6)经过本发明色谱条件的选择发现，本发明对4种主要脂肪酸的峰面积与其质 量浓度均有良好的线性关系，相关系数均大于〇. 998 ;加标回收率（n=6)为91. 0~105. 3%， 相对标准偏差为2. 20~3. 57 % ;最低定量限（S/N=10)为2. 0 mg/kg。
[0021] (7)本发明裂殖壶菌藻粉样品的使用量与内标物和盐酸的使用量存在密切的关 系，首先，内标物的加入量要与裂殖壶菌藻粉样品的量存在一定的对应关系，以保证添加的 内标质量与待测样品所含的DHA质量接近，提高检测结果的准确性；其次，盐酸的加入量要 保证裂殖壶菌藻粉水解完全，在这里，样品量增加与盐酸的加入量呈正比，以保证裂殖壶菌 藻粉水解完全，以保证DHA测定结果的准确性和可信度，因此，在实际操作过程中，为提高 检测结果的准确性，裂殖壶菌藻粉样品、内标物、盐酸（4 mol/L)的质量比控制在（0.2~ 0.8) :(4 ~6) :(4 ~6)〇
【附图说明】
[0022] 图1为本发明37种脂肪酸甲酯混合标准溶液出峰顺序图。
[0023] 图2为本发明未加内标物时供试品溶液的色谱图。
[0024] 图3为本发明供试品溶液的色谱图。
【具体实施方式】
[0025] 下面将本发明的发明目的、技术方案和有益效果作进一步详细的说明。
[0026] 应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对所要求的本发明提供进一步的说 明，除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技 术人员通常理解的相同含义。
[0027] 本发明是对裂殖壶菌藻粉中DHA的含量提出的使用气相色谱仪进行检测的测定 方法，检测对象选择裂殖壶菌藻粉，它与现有技术中如《裂殖壶菌DHA提取方法的优化和工 业化应用》和《富含DHA的裂殖壶菌的工业化生产试验、脂肪酸提取及应用研宄》中涉及的 试验对象不同，现有技术选择的试验对象是裂殖壶菌，属于真菌门（Eumycota)、网粘菌纲、 破囊壶菌目、破囊壶菌科的一类海洋真菌，单细胞、球形。裂殖壶菌藻粉，即裂殖壶菌干粉， 成分大致为脂质55%，DHA (C22:6n-3) 20%，C16:0 20%，其它脂肪酸含量低，该菌可通过异 养繁殖生产，该产品生产不受季节影响，无毒物污染，成分稳定；且全面面临鱼油供应紧缺， 其被认为是一种极具实现工业化生产DHA潜力的微生物，同时，裂殖壶菌藻粉也是一种理 想的DHA新生资源，已广泛应用于食品、药品和保健品。因此，基于目前对裂殖壶菌藻粉中 DHA的相关报道较少，而裂殖壶菌藻粉的应用已广泛普及的情况，本发明提出了一种裂殖壶 菌藻粉中DHA含量的测定方法，旨在为裂殖壶菌藻粉DHA的质量控制提供检测方法的依据。
[0028] 本发明方法作为裂殖壶菌藻粉DHA质量控制的检测依据，还满足以下条件： (1) 样品处理过程简单、操作程序简捷； (2) 测定结果重现性好、准确度和可行度较高； (3) 适合批量裂殖壶菌藻粉样品脂肪酸的定量测定； (4) 检测效率高，能满足37种脂肪酸甲酯获得较好的分离。
[0029] 以下是对本发明技术方案的进一步描述： 本发明所涉及的检测方法是使用气相色谱法对裂殖壶菌藻粉中提取的油脂进行的定 量检测，标准溶液选择Supelco 37种脂肪酸甲酯混合标准溶液(浓度为10 mg/mL)，裂殖壶 菌藻粉样品作为检测对象，测定过程中，选择十三烷酸内标溶液作为内标物，内标物在裂殖 壶菌藻粉油脂提取过程中加入，可以保证内标物与DHA完成同样的前处理过程，即酸热法 提取油脂一皂化一甲酯化一供试品溶液，从而保证了 DHA测定结果的准备性。
[0030] 使用气相色谱仪进行检测时，分别移取等量的供试品溶液和标准溶液1 μ L，注入 气相色谱仪中进行测定，检测条件满足： 色谱柱：石英毛细管柱，如：SP?-2560毛细管柱， 柱温：60~240°C， 检测器：氢火焰离子化检测器，检测器温度：250~270°C， 汽化室温度：240~260 °C ; 气体流量：载气为高纯氮，流速〇. 8~I. 2mL/min，空气流速300~400mL/min，氢气流 速 30 ~40mT,/min , 分流比：（5~20) :1。
[0031] 由上述检测条件可知，本发明以SP?-2560毛细管柱分离，氢火焰离子化检测器测 定，以样品峰的保留时间与脂肪酸甲酯标准品的保留时间定性，按内标法计算各脂肪酸的 含量。检测结果表明，在上述色谱条件下，37种脂肪酸甲酯在65 min内获得较好的分离，其 中，4种主要脂肪酸的峰面积与其质量浓度有良好的线性关系，相关系数均大于0. 998 ;加 标回收率（n=6)为91. 0~105. 3%，相对标准偏差为2. 20~3. 57 % ;最低定量限（S/N=10) 为 2. 0 mg/kg。
[0032] 为验证上述结果，现按照上述质谱检测条件，分别以标准溶液、未加内标物的 供试品溶液、加内标物的供试品溶液进样检测，进样量均为1 μ L，其中，如图1为37 种脂肪酸甲酯混合标准溶液出峰顺序图，图1中，l.C4:0 ;2. C6:0 ;3. C8:0 ;4. C10:0 ; 5. C11:0 ；6. C12:0 ；7. C13:0 ；8. C14:0 ；9. C14: I ；10. C15:0 ；11. C15: I ；12. C16:0 ； 13.C16:1 ；14. C17:0 ；15.C17:1 ；16. C18:0 ；17. C18:ln9t ；18.C18:ln9c ；19.C18:2n6t ； 20.C18:2n6c ；21.C20:0 ；22 .C18:3n6 ；23.C20:1 ；24.C18:3n3 ；25.C21:0 ；26.C20:2 ； 27. C22:0 ；28. C20 : 3n6 ；29. C22: ln9 ；30. C20:3n3 ；31. C20:4 n6 ；32. C23:0 ；33. C22:2 ； 34. C24:0 ;35. C20:5n3 ;36. C24:l ;37. C22:6n3。图2为未加内标物供试品溶液的色谱图， 图 2 中，2. C14:0 ;3· C14:1 ;4· C15:0 ;5· C16:0 ;6· C16:1 ;7· C17:0 ;8· C18:0 ;9· C18: ln9t ; 10. C18: ln9c ；11. C20:0 ；12. C22: ln9 ；13. C20:3n3 ；14. C22:2 ；15. C20:5n3 ；16. C22:6n6 ； 17. C22:6n3。图3为加内标物供试品溶液的色谱图，图3中，I. C13:0 ;2. C14:0 ;3. C14:1 ; 4. C15:0 ；5. C16:0 ；6. C16:1 -J. C17:0 ；8. C18:0 ；9. C18: ln9t ；10. C18: ln9c ；11. C20:0 ； 12. C22:ln9 ；13. C20:3n3 ；14. C22:2 ；15. C20:5n3 ；16.C22:6n6 ；17.C22:6n3〇
[0033] 下面以几个典型实施例来列举说明本发明的【具体实施方式】，当然，本发明的保护 范围并不局限于以下实施例。
[0034] 实施例1 : 本实施例涉及的测定方法具有以下步骤： A :备样，取标准溶液和裂殖壶菌藻粉样品，在裂殖壶菌藻粉样品中加入十三烷酸内标 溶液和盐酸，混合后提取油脂； B :制备供试品溶液，将步骤A提取的油脂依次皂化、甲酯化后制得脂肪酸甲酯溶液，在 脂肪酸甲酯溶液中加入异辛烷和饱和NaCl溶液，经混合、静置分层后，移取上层清液，脱水 后制得供试品溶液，备用； C :测定，分别移取等量的供试品溶液和标准溶液1 μ L，注入气相色谱仪中进行测定， 测定条件包括： 色谱柱：石英毛细管柱， 柱温：60°C， 检测器：氢火焰离子化检测器，检测器温度：250°C， 汽化室温度：240 °C ; 气体流量：载气为高纯氮，流速〇. 8mL/min，空气流速300mL/min，氢气流速30mL/min， 分流比：5 :1。
[0035] 实施例2 : 本实施例与实施例1的区别在于：在步骤A中，盐酸的浓度为4 mol/L，裂殖壶菌藻粉 样品、内标物、盐酸的质量比为〇. 2 :4 :4。
[0036] 实施例3 : 本实施例与实施例1的区别在于：在步骤A中，盐酸的浓度为4 mol