生成速率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种原位检测单个活细胞内细胞器中c〇2生成速率的方法，属于生物 巧光标记与细胞生物学领域。
【背景技术】
[0002] 细胞作为所有生物体内最小的功能和结构单元，其内部不停地进行着新陈代谢过 程，而该一过程又与二氧化碳的循环密切相关。细胞内二氧化碳的含量在呼吸作用、核酸碱 基对的形成、血液抑值的平衡、基因复制、细胞增殖及癌变等过程中起着至关重要的作用。 细胞内各细胞器起着独一无二的生理作用，如线粒体行使着呼吸作用、提供能量的中转站， 内质网负责运输和贬藏蛋白质，高尔基体与细胞的分泌过程密切相关，而溶酶体则作为"消 化车间"分解衰老损伤的细胞器、吞瞻并杀死侵入细胞的病毒和病菌等。因此，原位检测细 胞内各细胞器中二氧化碳的生成速率对细胞器功能的深入研究、疾病的早期诊断和物种的 进化有着十分重要的意义。
[0003] 目前，大多数文献已报道，在气体混合物中检测二氧化碳的含量，如大气、海洋生 态系统、天然气的燃烧等。其中，电化学和红外分析方法是两种探测二氧化碳的最常见方 法，然而该两种方法由于对水较敏感而不适用于潮湿的环境下，因而更不能用于生物体系 中二氧化碳的检测。另外，巧光蛋白、无机量子点等作为一种新型的巧光探针近年来被广 泛用于活细胞成像，但由于对细胞的高毒性及对二氧化碳的无明显响应等问题而无法用于 原位检测细胞内各细胞器新陈代谢的过程。（Cummins, E.P. ;Selfridge，A.C. ;Sporn，P. 比Sznajder, J. I. ;Taylor, C. T. Cell Mol. Life Sci.，2014, 71，831-845. Liu, Y. ;Tang, Y. H. ;Barashkov, N. N. ; Irgibaeva, I. S. ;Lam, J. W. Y. ;Hu,民.民.；Birimzhanova, D. ;Yu, Y.; Tang, B. Z. J. Am. Chem. Soc.，2010，132，13951-13953. Carballal, S. ;Bartesaghi, S.; 民adi，R.Biochimica et Biophysica Acta, 2014, 1840, 768-780. Ali，R. ;Lang，T.; Saleh, S. M. ;Meier, R. J". ;Wolfbeis, 0. S. Anal. Chem.，2011, 83, 2846-2851.加o, C. X.; Ng，S.R. ;Khoo，S.Y. ;Zheng，X.T. ;Chen，P. ;Li，C.M. Acs Nano. ,2012,6, 6944-6951. Waldrop, G. L. ;Holden, H. M. ;Maurice,M. S. Protein Science, 2012, 21，1597-1619. Guais, A. ;Brand, G. ; Jacquot, L. ;Karrer，M. ;Dukan, S. ;Grevillot, G. ;Molina，T. J.; Bonte, J. ;Regnier, M. ;Schwartz, L Qiem. Res. Toxicol.，2011，24, 2061-2070)。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种原位检测单个活细胞内细胞器中c〇2生成 速率的方法，所述方法采用一种含有4, 4'，化咯-1，2, 5-S基）S苯甲酸（2-二甲 氨基）己醋（TPP-TMA巧的巧光探针对活细胞各细胞器的新陈代谢过程进行检测，所述巧光 探针用于活细胞巧光成像的同时可原位定量检测单个细胞内各细胞器二氧化碳的生成速 率，并能有效甄别癌细胞和正常细胞。
[0005] 本发明的目的由W下技术方案实现：
[0006] 一种原位检测单个活细胞内细胞器中c〇2生成速率的方法，所述方法具体步骤如 下：
[0007] (1)将TPP-TMAE溶解于二甲基亚讽值MSO)中，得到浓度为lXl〇-2mol/L的溶液 a;向溶液a中加入高糖DMEM培养基，得到浓度为1X10可1〇1/1的溶液b;
[0008]所述TPP-TMAE为 4, 4'，化咯-1，2, 5-S基）S苯甲酸（2-二甲氨基）己 醋的简写，TPP-TME的结构式如下；
[0009]
[0010] 似将细胞器染料溶解于；蒸水中，得到浓度为lXl(T5mol/L的溶液C;
[0011] (3)将细胞传代至两组培养皿中，将培养皿置于培养箱中培养至细胞数达 5X105±0. 05X105个，移除培养基，洗漆；向其中一组培养皿中加入体积为V1的溶液C，并 将所述培养皿置于培养箱中培养15~30min，移除溶液C，洗漆，加入体积为V2的高糖DMEM 培养基，得到待测样品1 ;向另外一组培养皿中加入体积为Vi的溶液C，并将所述培养皿置 于培养箱中培养15~30min，移除溶液C，洗漆，加入体积为vi的溶液b，5秒后移除溶液b， 洗漆，加入体积为V2的质量浓度为4%的多聚甲醒溶液，静置lOmin，洗漆，加入ImL抑= 7. 4的磯酸盐缓冲液，得到含有失活细胞的待测样品2;
[0012] 其中，所述培养皿为激光共聚焦显微镜专用底部带玻片培养皿，外径为20mm
[0013] 所述培养箱培养环境；温度为37°C、CA的体积分数为5%;-组培养皿为3~5 个；
[0014] 所述洗漆采用抑=7. 4的磯酸盐缓冲液，洗漆次数为2~3次；所述PBS溶液为 pH= 7. 4的磯酸盐缓冲液的简称；所述Vi:V2为！ ： 10 ;
[0015] (4)向待测样品1中加入体积为Vi的溶液b，每间隔Ih测试一次待测样品1中细 胞内各细胞器的巧光强度，共测试6~10次；并根据测试结果绘制单个细胞细胞器内巧光 强度变化率随时间t的变化曲线，得到曲线一；
[0016] 其中，加入溶液b时，需保持待测样品1位置不变；
[0017] 待测样品1中单个细胞细胞器内巧光强度变化率=(li-IoVl。，I。表示单个细胞 细胞器内的初始巧光强度，li表示第i次检测时单个细胞细胞器内的巧光强度，i为！~5 的正整数；
[001引 （5)先测试出待测样品1中细胞内细胞器的初始巧光强度；再分次向待测样品2 中注入气体，测试每次注入气体后待测样品2中失活细胞内各细胞器的巧光强度；其中，每 次每个待测样品2中注入气体的体积为1yL气体的注入总量为20yL;根据测试结果绘制 待测样品2中失活细胞通入气体后单个细胞器的巧光强度变化率随通入气体体积的变化 曲线，得到曲线二；
[0019] 其中，所述气体为C〇2与空气的混合气体，C〇2与空气的体积比1:1 ;
[0020] 待测样品2中失活单个细胞细胞器内巧光强度变化率=(I'k-I'oVi'。，1'。 表示失活单个细胞细胞器内的初始巧光强度，I'k表示第k次通入气体后失活单个细胞细 胞器内的巧光强度，k为1~20的正整数；
[0021] 做根据步骤（4)、（5)待测样品1和待测样品2中细胞内各细胞器巧光强度的测 试结果计算单个细胞内各细胞器新陈代谢过程中C〇2含量，具体为：
[0022] 当曲线一和曲线二中的巧光变化率相同时，分别得到曲线一中对应的时间t和曲 线二中对应的通入气体的体积V;所述体积V中失活细胞内C〇2气体的含量即为单个细胞细 胞器在时间t内自身新陈代谢产生的0)2的量；
[002引所述失活细胞内含有的C02气体的体积的测试方法如下；
[0024] (a)将细胞传代至一组培养皿中，将培养皿置于培养箱中培养8~20h，洗漆，加入 ImL质量百分含量为4%的多聚甲醒溶液，静置lOmin，洗漆，加入ImLPBS溶液，向各培养皿 中通入0~20yL"C02与空气的混合气体，立即用PBS溶液离心洗立次，去除上清液，收集 细胞，冷冻抽真空干燥，得到含有失活细胞的待测样品3 ;
[0025] 其中，"C化与空气的体积比为1:1 ;
[0026] 所述培养箱培养环境；温度为37°C、C〇2的体积分数为5% ;-组培养皿的个数为 21个；
[0027] 所述离屯、的转数优选1000巧m，离屯、时间优选lOmin;
[002引 化）用同位素法测定待测样品3的失活细胞中"C的含量，从而得到通入C02后进 入失活细胞内的C02气体的含量；
[0029] 其中，步骤（4)和步骤巧）中所述巧光强度的测试均采用激光共聚焦显微镜；
[0030] 步骤（2)所述细胞器染料优选线粒体染料、内质网染料、高尔基体染料和溶酶体 染料中的一种；
[0031] 步骤（3)所述细胞优选人子宫颈癌细胞化eLacell)、人乳腺癌细胞（MCF-7 cell)和CD1小鼠胚胎成纤维细胞（MEFcell)中的一种。
[0032] 有益效果；
[003引 （1)本发明所述方法采用的TPP-TMAE对化Lacell、MCF-7cell及正常细胞模型 MEFcell内各细胞器代谢产生的二氧化碳具有特异性巧光响应；可定量检测癌细胞及正常 细胞细胞器中新陈代谢产生的二氧化碳的速率；
[0034] 似本发明所述方法采用TPP-TMAE对同一个细胞中不同细胞器（线粒体 (mitochon化ia)、内质网（endoplasmicreti州lum)、高尔基体（golgiapparatus)、溶酶体 (lysosome))代谢产生的二氧化碳巧光响应不同，说明同一个细胞中不同细胞器代谢产生 二氧化碳速率不同，可用于比较各细胞器新陈代谢过程的快慢，并有效鉴别出新陈代谢过 程的主要细胞器；
[0035] (3)本发明所述方法采用TPP-TMAE对癌细胞化eLacell、MCF-7cell)和正常细 胞（MEFcell)内同一细胞器代谢产生的二氧化碳的速率不同，导致