一种镍-IgE螯合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测领域，更具体地说，涉及一种镍-IgE螯合物及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] IgE主要由粘膜相关淋巴样组织产生，其中大部分是由胃肠淋巴样组织所合成，少 部分由呼吸道、唾液腺和生殖道粘膜组织合成。哺乳期产妇腺组织含有大量IgE产生细胞， 这些细胞主要来自胃肠。在人类，还有少量的IgE来自骨髓。人出生后4~6月开始合成 IgE，4~12岁血清中含量达成人水平，血清型IgE总Ig的10 %左右，半衰期约5~6天。 IgE有IgEl和IgE2两个亚类。IgEl主要存在于血清中，约占血清中IgE的85%，a1链分 子量为56kD;IgE2主要存在于外分泌液中，少部分以血清型IgE存在，约占血清中IgE的 15%，a2链缺乏铰链区，分子量为52kD。血清中的IgE除单体形式外还有由J链共价相连 的二聚体或三聚体等形式。分泌型IgE是由J连接的双体和分泌成分所组成，主要存在于 初乳、唾液、泪液、胃肠液、支气管分泌等外分泌液中，是粘膜局部免疫的最重要因素，分泌 型IgE通过与相应的病原微生物（如脊髓灰质炎病毒）结合，阻抑其吸附到易感细胞上，分 泌型IgE还可中和毒素如霍乱弧菌毒素和大肠杆毒素等。新生儿易患呼吸道、胃肠道感染 可能与IgE合成不足有关。慢性支气管炎发作与分泌型IgE的减少也有一定关系。产妇可 通过初乳将分泌型IgE传递给婴儿，这也是一种重要的自然被动免疫。嗜酸性粒细胞、中性 粒细胞和巨噬细胞表达FcaR，血清型单体IgE可介导调理吞噬和ADCC作用。此外，分泌 型IgE具有免疫排除功能，即分泌型IgE结合饮食中大量的可溶性抗原以及肠道正常菌群 或病原微生物所释放的热原物质，防止它们进入血液。
[0003] 众所周知，镍（Nickel，Ni)与人体的健康息息相关，首先其是人体维持健康所必 需的微量元素，其存在于多种氢化酶中，催化氢的氧化还原反应，参与多种酶蛋白的合成和 细胞激素及色素的代谢，具有促进铁的吸收和红细胞的增长、激活酶形成辅酶、增强胰岛 素、降血糖、保护心血管等作用，因此如果人体缺乏镍，会导致疾病的发生。但是，事实在生 活中，由于环境污染，人体内很少缺乏镍，相反镍的含量常常过量，常常导致疾病的发生，甚 至危及生命。
[0004] 镍作为一种常见的有毒金属，广泛应用于生活、生产之中，包括生产硬币、珠宝、镍 合金不锈钢、制造Ni-Cd电池等，与人们的生活息息相关。随着科技的进步，人们将镍作为 催化剂用于生产碳纳米颗粒的生产之中，又进一步加深了镍对于人类的影响。对于普通人 群，镍主要是通过食入、饮入、接触等方式摄入镍，当然吸烟也是一重要途径。研究发现，过 量的镍会导致机体多处组织及器官损伤，导致多种疾病的发生，包括呼吸系统疾病（肺炎、 支气管炎、肺纤维化、哮喘、肺水肿等）、心血管疾病、肾脏疾病、皮肤疾病等，甚至还会导致 肿瘤的发生。
[0005] 流行病学资料显示，长期接触镍的工人，其患呼吸系统肿瘤的几率大大增加，并且 其因呼吸系统肿瘤致死的几率也大大增加。动物模型、体外模型试验也发现，镍可以诱导肿 瘤的发生。1990年，国际癌症研究机构（InternationalAgencyforResearchonCancer，IARC)已将镍化合物作为第一类致癌物质（Group1)，将金属镍作为2B类致癌物质（Group 2B)。可见，镍严重威胁人体的健康。
[0006] 镍与多种蛋白质之间关系密切，可以与多种蛋白质结合，抑制多种蛋白酶的活性。 随着对镍毒性研究的深入，人们逐渐认识到镍与蛋白的相互作用在其致毒过程中扮演着重 要的角色，被认为是了解镍的毒性机理的关键所在，因此，对镍和蛋白质相互作用的研究就 显得愈发重要。而现在关于镍与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋白质与镍之 间的关系还不清楚，因而加强对于镍与蛋白质之间的关系至关重要。
【发明内容】
[0007] 针对镍污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种镍-IgE螯合物及其制备方 法，并建立镍-IgE螯合物的定性、定量检测方法，以便定量检测镍-IgE螯合物在评价一个 地区镍污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中镍-IgE螯合物可以间接反映 这个地区人群受镍污染的情况，从而间接反映这个地区镍污染程度。
[0008] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种镍-IgE螯合物，镍离子与 IgE通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。
[0009] 本发明还提供一种上述的镍-IgE螯合物的制备方法，包括以下步骤：
[0010] A)镍与IgE的螯合反应：在提纯源于人体的IgE或按照生物学方法重组的IgE中 加入镍离子进行螯合反应，得到反应溶液；
[0011] B)纯化镍-IgE螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的 IgE以及多余的镍离子，即得镍-IgE螯合物。
[0012] 其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下：
[0013] (1)溶解样品：向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水使镍-IgE螯合物 复溶；
[0014] (2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgE特 异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0015] (3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤⑴中样品，然后上柱，IgE与 填料特异性结合；
[0016] (4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.lmol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液I;
[0017] (5)收集：收集洗脱液I;
[0018] (6)透析：将步骤（5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0019] (7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与镍特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0020] (8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6)中样本，然后上柱；
[0021] (9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1. 0m〇l/L的磷 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液II;
[0022] (10)收集：收集洗脱液II;
[0023] (11)透析：将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三 次后，4°C透析过夜，收集样本，即得镍-IgE螯合物。
[0024] 其中，上述镍-IgE螯合物的制备方法，还包括步骤C):对镍-IgE螯合物的鉴定；
[0025] 其中，步骤C)中具体如下：
[0026] (1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[0027] (2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的镍-IgE螯合物，加入稀释缓冲液，并混匀， 然后加样于样品槽中；
[0028] (3)电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0029] (4)检测：在胶床上找出含镍的蛋白条带，将该蛋白条带取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法检测是否含有镍以及检测镍的含量。
[0030] 本发明还提供一种如上述的镍-IgE螯合物在制备检测人体内镍-IgE螯合物的试 剂或试剂盒中的应用。
[0031] 本发明还提供一种至少包括如上述的镍-IgE螯合物作为标准品的试剂盒。
[0032] 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获IgE的物质或捕获镍的物 质。
[0033] 本发明还提供一种定量检测镍-IgE螯合物的方法，以已知含量的上述的镍-IgE 螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收 光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯镍-IgE螯合物与酶联免疫结 合法、提纯镍-IgE螯合物与原子吸收光谱结合法、提纯镍-IgE螯合物与电感耦合等离子体 质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。
[0034] 实施本发明的镍-IgE螯合物及其制备方法和应用，具有以下有益效果：
[0035] 1.本发明首次体外合成镍-IgE螯合物；
[0036] 2.本发明首次提出镍-IgE螯合物可用于制备检测血样中镍-IgE螯合物的试剂或 试剂盒中的应用。
[0037] 3.本发明建立了镍-IgE螯合物的定性定量检测方法，以便定量检测镍-IgE螯合 物在评价一个地区镍污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中镍-IgE螯合物 可以间接反映这个地区人群受镍污染的情况，从而间接反映这个地区镍污染程度。本发明 建立的镍-IgE螯合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提 尚。
【附图说明】
[0038]图1为本发明所述的镍-IgE螯合物的非变性电泳条带图；
[0039]图2为本发明所述的镍-IgE螯合物的电泳条带的同步辐射X线荧光分析图。
【具体实施方式】
[0040] 下面，结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0041] 本发明除特别说明外，涉及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤，所用试剂、材 料如下述所列举，在本发明中没有列举出来的均为本领域常用的试剂或可以通过市购方式 获得：
[0042] 磷酸盐溶液为 0? 05-0.lmol/LNa2HP04溶液或 0? 5-lmol/LNa2HP04溶液；
[0043] 提取试剂为PEG溶液、硼酸盐缓冲液等（采用PEG法）；
[0044] 胶床介质为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种；
[0045] 捕获IgE的物质购买自艾美捷科技有限公司的型号为Abeamabl71396的兔 Anti-IgE抗体；其中，本发明所述与IgE特异性结合的物质、抗IgE抗体、抗IgE抗体均为 捕获IgE的物质；
[0046] 捕获镍的物质为广州然科公司生产的型号为RK14419的抗镍抗体；其中，本发明 所述与镍特异性结合的物质、Ni抗、抗Ni抗体、抗镍抗体均为捕获镍的物质；
[0047] 酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体中的一种；
[0048] 底物为甲基联苯胺（TMB)溶液；
[0049] 洗