去未与IgE结 合的ITCBE;
[0158] 5)将步骤4)所得的液体用lmol/LHC1调节pH值至7. 0,然后缓慢逐渐滴加80y1 的lmmol/L镍离子溶液，边滴加边振荡，以免镍离子使蛋白变性沉淀；
[0159]6)将步骤5)所得的溶液置于温度为25°C，转速为100r/min的摇床中反应2h，用 透析袋进行透析24h;
[0160] 7)将步骤6)透析后的液体于-20°C分装保存，得到反应溶液。
[0161] B)纯化镍-IgE螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液（即步骤7)得 到的反应溶液）中未反应的IgE以及多余的镍离子，即得镍-IgE螯合物，具体步骤如下：
[0162] (1)溶解样品：向经过步骤7)得到的反应溶液中加入生理盐水使镍-IgE螯合物 复溶；
[0163] (2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgE特 异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0164] (3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，IgE与 填料特异性结合；
[0165] (4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.lmol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液I;
[0166] (5)收集：收集洗脱液I;
[0167] (6)透析：将步骤（5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0168] (7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与镍特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0169] (8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6)中样本，然后上柱；
[0170] (9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液II;
[0171] (10)收集：收集洗脱液II;
[0172] (11)透析：将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用2升ddH20透析除盐，换 水三次后，4°C透析过夜，收集样本，即得镍-IgE螯合物；
[0173] C)对镍-IgE螯合物的鉴定，具体步骤如下：
[0174] (1)制备胶床：以琼脂糖凝胶作为介质制备胶床；
[0175] (2)加样：取步骤B)中8yL提取纯化得到的镍-IgE螯合物，加入2yL上样缓冲 液，并混匀，然后加样于样品槽中；
[0176](3)电泳：连接电泳板，加入电泳缓冲液进行电泳；电泳过程中，电流为22mA恒流， 环境温度为4°C;电泳至溴酚蓝移至胶底部时停止电泳；
[0177] (4)检测：在胶床上找出含镍的蛋白条带，将该蛋白条带取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法检测是否含有镍以及检测镍的含量。
[0178] D)检测结果
[0179] (1)石墨炉原子吸收光谱法（AAS)初步测定IgE中重金属含量：结果见表1
[0180] 表1为IgE中重金属含量（yg/L)
[0181]
[0182]
[0183] (2)电泳结果：
[0184] 其中，图1为本发明所述的镍-IgE螯合物的非变性电泳条带图。
[0185] 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE)或称为活性电泳是在不加入SDS和疏 基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于酶的鉴 定、同工酶分析和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过 程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迀移率的不同和凝胶的分子筛作 用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子 的生物活性，因此左边泳道M为变性Marker，只用于检测，没有标记作用，泳道4为IgE的条 带。
[0186] (3)同步辐射X荧光分析：
[0187] 蛋白条带内微量元素含量的SRXRF分析在北京正负电子对撞机（BEPC)的4W1〃 同步辐射束线上完成。储存环中电子束流能量为2. 2GeV，束流强度100mA。样品移动台 (TSA200型，北京卓立汉光公司）可在计算机控制的步进马达驱动下沿X、Y二维方向上移 动以改变入射光斑位置，移动步长为〇. 〇〇25_。从样品发射出的X射线由Si(Li)探测器 (PGTInc.LS30143-DS)探测，探头与入射SR线共平面且相互垂直，距样品照射点20mm，信 号用PGT多道分析仪（MCA4000)获取输出。用11. 5keV的单色同步辐射光激发样品，调节 入射光斑（lmmx3mm)位置使之处于条带一端，在300s的测定时间内，光斑一直沿条带均勾 缓慢移动，计数结束时光斑移到该条带另一端。沿电泳方向每1mm取一个谱。采用AXIL 软件处理数据，并用来源于空气且含量恒定的Ar信号峰对其它元素峰进行归一处理，以抵 消束流强度变化对信号强弱产生的影响。在相同的条件下以同样的方式测量定量标准干胶 膜的荧光谱。
[0188] 图2为本发明所述的镍-IgE螯合物的电泳条带的同步辐射X线荧光分析图，图中 横坐标为蛋白条带位置，纵坐标为该条带各金属能量（含量）值。
[0189]本发明一种宙量检测镍-IgE罄合物的方法的检测条件的确宙：
[0190] 1.抗IgE抗体、抗镍抗体最佳工作浓度以及血楽:的最佳稀释倍数的确定
[0191] 步骤如下：
[0192] (1)将抗IgEAb用稀释缓冲液按照抗IgEAb与稀释缓冲液的质量体积比为 1:1000、1:2000、1:4000、1:8000进行稀释，加入ELISA板微孔中，将抗IgEAb包被于固相载 体上，每个浓度包被三排，4°C过夜18小时；
[0193] (2)移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，用2%牛血清白蛋白 作为封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤；
[0194] (3)待检样品按待检样品与稀释缓冲液的质量体积比为1:10、1:20、1:40进行稀 释，加入微孔中，按照上述包被的抗IgEAb浓度，同一个浓度的抗IgEAb的分别加入不同 稀释度血浆，37°C作用1小时；
[0195] (4)移去待检样品，并用洗潘液进彳丁洗潘，待洗潘完成后，加入抗NiAb，抗NiAb 按抗NiAb与稀释缓冲液的质量体积比为1:5000、1:10000、1:20000、1:40000进行稀释，按 照每一个相同抗IgEAb、血浆稀释浓度，不同浓度抗NiAb各加2孔，37°C作用1小时，使抗 NiAb与IgE上的金属镍反应；
[0196] (5)酶标抗体选择最适工作浓度，即2iig/mL，移去抗Ni抗体，并用洗涤液进行洗 涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释HRP酶标抗体，37°C作用1小时，使HRP酶标抗体 与镍-IgE螯合物反应；
[0197] (6)移去酶标抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37°C避光作用 30分钟；
[0198] (7)将终止液滴加至每一微孔；
[0199] (8)取波长405nm，加完终止液后，将ELISA板置于酶标仪上检测，分别读取各孔0D 值。根据各孔0D值数值，选择抗IgEAb、抗NiAb的最佳工作浓度以及血浆的最佳稀释倍 数。
[0200] 试验中同时以所制标准品作为阳性对照，选择抗IgEAb+封闭+抗NiAb+酶标+ 底物（即不加待检样品）作为阴性对照1 ;抗IgEAb+封闭+血浆+酶标+底物（即不加抗 NiAb)作为阴性对照2 ;抗IgEAb+封闭+酶标+底物（即不加待检样品和抗NiAb)作为 阴性对照3 ;抗IgEAb+封闭+血浆+抗NiAb+底物（即不加酶标）作为阴性对照4 ;封闭 +血浆+抗NiAb+酶标+底物（即不加抗IgEAb捕获IgE)作为空白对照1 ;只加底物作 为空白对照2及PBS作为空白对照3。检测结果见表2-3。
[0201] 表2 :棋盘滴定法确定抗IgEAb、抗NiAb的最佳工作浓度以及血浆的最佳稀释倍 数的数据（每个数据皆为平均值）
[0202] CN 105004684 A ^ m TJ 13/18 页
[0203] 表3 :ELISA阳性对照及阴性对照ELISA检测结果
[0204]
[0205] 由表2-3数据显示，我们可以看出抗IgE抗体的稀释度为1:2000、血浆稀释度为 1:10、Ni抗稀释度为1:10000时，0D值最大，所以选此值所对应的浓度作为最佳工作浓度。
[0206] 2.定量检测镍-IgE螯合物的方法中方法二、三中洗脱液最佳工作浓度及洗脱时 间的确定
[0207] 步骤如下：（1)包被：将抗NiAb用稀释缓冲液稀释至10000倍（质量体积比），加 入ELISA板微孔中，37°C水浴3小时，储存冰箱；
[0208] (2)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，用2%牛血清白 蛋白作为封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤；
[0209] (3)移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释的 酶标抗体，酶标抗体稀释至浓度为2yg/mL，37°C作用2小时，使其与抗NiAb反应；
[0210] (4)准备洗脱液：将木瓜蛋白酶用pH8.0,0.lmol/LTris-HCI缓冲液配制成 100ng/ml，再加入lmmol/L二硫苏糖醇（DIT)37°C孵育 30min;
[0211] (5)移去酶标抗体，用稀释缓冲液对洗脱液进行稀释，使洗脱液中的木瓜蛋白酶的 浓度与酶标抗体的浓度之比为1:80、1:40、1:20、1:10、1:5 (其中每个浓度作3个复孔），分 别放置于37°C温度下洗脱lh、2h、3h;
[0212] (6)移去洗脱液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37°C避光作用 30分钟；
[0213] (7)将终止液滴加至每一微孔；
[0214] (8)取405nm波长，加完终止液后，将ELISA板置于酶标仪上检测，分别读取每组 0D值，通过与PBS缓冲液组比较，比较出洗脱液的最适浓度及洗脱时间，具体结果参见表4。
[0215]