一种甲氧檗因测定的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于化学发光技术领域，具体为一种甲氧檗因测定的方法。
【背景技术】
[0002] 小分子甲氧檗因是一种新月形的平面生物碱，当与富含A碱基的DNA作用时， 一个甲氧檗因分子可特异性的结合四个A碱基。目前，基于甲氧檗因与富含A碱基的 DNA的特异性结合，已经建立了多种用于甲氧檗因的检测方法。近年来甲氧檗因测定 方法主要有：基于纳米银颗粒的免标记比色方法（LvZZ，WeiH，LiBL.Colorimetric recognitionofthecoralyne-poly(dA)interactionusingunmodifiedgold nanoparticleprobes,andfurtherdetectionofcoralynebaseduponthis recognitionsystem.Analyst. 2009, 134(8) : 1647-1651);基于纳米银颗粒的免标记 比色方法对甲氧檗因的检测方法（XuXW,WangJ,YangF.Label-freecolorimetric detectionofsmallmoleculesutilizingDNAoligonucleotidesandsilver nanoparticles.Small. 2009,5(23):2669-2672);光度法（HouT，LiCX，WangXZ，Zhao C,LiF.Label-freecolorimetricdetectionofcoralyneutilizingperoxidase-like splitG-quadruplexDNAzyme.AnalyticalMethods. 2013. 5 ;4671 _ 4674);双偏振 干涉法(WangY,WangJ，YangF.Probingbiomolecularinteractionswithdual polarizationinterferometry:real-timeandlabel-freecoralynedetectionbyuse ofhomoadenineDNAoligonucleotide.AnalyticalChemisty. 2012,84(2):924_930)和 焚光法（ZhangP,WangY,LengF,XiongZH,HuangCZ.Highlyselectiveandsensitive detectionofcoralynebasedonthebindingchemistryofaptamerandgraphene oxide.Talanta. 2013. 15 ;112:117-22)等。但是，这些方法的各有其缺点，本发明利用MoS2 为载体，以异硫氰酸荧光素FITC为标记物，实现了甲氧檗因的测定，具有方法简单、成本 低、灵敏度高的优点。
【发明内容】
[0003] 本发明目的是提供一种测定甲氧檗因的方法，利用M〇S2为载体，以硫氰酸荧光素 FITC为标记物，光二极管诱导化学发光为检测方法，实现甲氧檗因的测定。
[0004] 技术方案
[0005] -种甲氧檗因测定的方法，其特征在于用M〇S2为载体，以硫氰酸荧光素FITC为标 记物，光二极管诱导化学发光为检测方法，实现甲氧檗因的测定，测定步骤如下：
[0006] (l)M〇S2的制备，制备、储存M〇S2溶液所用的玻璃容器：容量瓶、棕色广口瓶和圆 底烧瓶等用王水浸泡后，用二次蒸馏水洗涤干净后，吹干备用。然后，将M〇S2粉体分散到二 甲基甲酰胺DMF中，得到MoS^DMF溶液。将该溶液在室温下超声。然后离心分离，离心 10min得到黑色沉淀。最后，收集沉淀物，经过水洗涤，然后再分散于lmL水中。
[0007] (2)异硫氰酸荧光素标记的探针DNA在MoS^面组装，将100yL8ygmL1的MoS2 溶液与100yLlOnmol1的异硫氰酸荧光素标记DNA探针溶液混合，室温下反应20分钟；
[0008] (3)甲氧檗因的测定，取100yL含有甲氧檗因的样品溶液加入到上述⑵的溶液 中，室温下，反应20分钟。然后在12000转/分钟条件下，离心分离10分钟。取上清液加 入到含有200iiLpH11.3的鲁米诺溶液的小烧杯中，打开光二极管，15秒后关闭光二极 管，用化学发光仪检测化学发光信号，根据化学发光信号强度对目标物甲氧檗因进行定量 分析；
[0009] 本发明的化学试剂优选分析纯试剂，所有溶液均用二次蒸馏水配置。
[0010] 本发明的DNA序列为 5' -FITC-AAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'。
[0011] 本发明的化学发光测定选用MPI-E型化学发光分析系统（西安瑞迈分析仪器有限 公司）。
[0012] 本发明的离心机选用Anke-TGL_16C飞翁牌高速离心机（上海市安亭科学仪器 厂）。
[0013] 本发明的LED选用PHS-3D型酸度计（上海雷磁仪器厂）。
[0014] 本发明的显著效果
[0015] 本发明研究了甲氧檗因与发光强度之间的关系，得到了检测甲氧檗因的标准曲 线，线性范围及线性方程。
[0016] 当甲氧檗因的浓度在5nM-700nM之间时，随着甲氧檗因浓度的变化，化学发光强 度有明显变化，其线性回归方程是Ia= 9. 9445X-70. 391(I是体系的化学发光强度；x是 甲氧檗因的浓度，nM;n= 12,n表示同一浓度测定次数，R2= 0. 9990)，检测限是InM。
[0017] 该测定方法的精密度通过对浓度为30nM的甲氧檗因进行11次平行测定而计算得 出，相对标准偏差为4. 3%，表明本发明的测定方法有较好的重现性。
【附图说明】
[0018] 图1.硫氰酸荧光素标记物DNA测定甲氧檗因的原理图。
[0019] 图2.甲氧檗因标准曲线。横坐标是甲氧檗因浓度C_，纵坐标为化学发光强度Ia。
【具体实施方式】
[0020] 按照技术方案的步骤（1)至（3)得到甲氧檗因标准曲线（图2);甲氧檗因购于 SigmaAldrich;M〇S2溶液均购于天津市博迪化工有限公司；鲁米诺溶液购于上海晶纯生化 科技股份有限公司；二甲基甲酰胺（DMF)购自上海化学试剂厂；异硫氰酸荧光素标记DNA 购自上海赛百盛基因技术有限公司。
[0021] 根据发明的方法对甲氧檗因含量进行了测定，并采用标准加入法对方法进行了评 价，样品测定回收率为96. 7 - 101. 5%，测定结果见表1，本发明的方法在甲氧檗因检测中 具有精密度高的特点。
[0022] 表1.样品分析测定结果
[0023]
[0024] a 7次测量结果
[0025] b单位：nM。
【主权项】
1. 一种甲氧檗因测定的方法，其特征是包括以下步骤： (1) 将100 y L 8 y g mL 1的MoS 2溶液与100 y L IOnmol吨1的异硫氰酸荧光素标记的 DNA探针混合，室温下反应20分钟； (2) 取IOOiiL含有甲氧檗因的样品溶液加入到上述（1)的溶液中，室温下，反应20分 钟； (3) 然后，在12000转/分钟的条件下，离心分离10分钟，取上清液加入到含有200 y L pH 11. 3的鲁米诺溶液的小烧杯中，打开光二极管，15秒后关闭光二极管，用化学发光仪检 测化学发光信号，根据化学发光信号强度对目标物甲氧檗因进行定量分析。2. 根据权利要求1的一种甲氧檗因测定的方法，其特征在于所述的MoS 2溶液按如下方 法制备而成：将此&粉体分散到得到二甲基甲酰胺DMF中，得到Img ? mL 1溶液，将该溶液 在室温下超声4小时，然后在8000转/分钟的条件下，离心10min得到黑色沉淀，最后，收 集沉淀物，经过水洗涤，然后再分散于ImL水，形成0.1 mg ? mL 1的溶液。3. 根据权利要求1的一种甲氧檗因测定的方法，其特征在于所述的鲁米诺溶液按如下 方法配置而成：准确称取177mg鲁米诺于烧杯中，并加入IOOmL 0.1 M的氢氧化钠将其溶解， 配置好的溶液避光保存两周后使用。4. 根据权利要求1的一种甲氧檗因测定的方法，其特征在于所述的DNA的部分序列为 5' -FITC-AAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'。
【专利摘要】一种甲氧檗因测定的方法，属于化学发光技术领域，其特征是利用以硫氰酸荧光素FITC标记DNA为信号探针，以MoS2为载体将探针吸附在其表面，当含甲氧檗因的样品溶液加入后，甲氧檗因与探针作用使得探针脱离MoS2载体表面，离心分离后上清液在光二极管照射下产生化学发光，根据化学发光强弱实现了甲氧檗因的检测。本发明方法简单、成本低。
【IPC分类】G01N21/76
【公开号】CN105004713
【申请号】CN201510325745
【发明人】混旭, 李庚
【申请人】青岛科技大学
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年6月12日