坐标表示SERS谱峰的相对强度，单位为任意单位(a.u.)横坐标表示各谱线的峰位置，以波数(cm 表示。
【具体实施方式】
[0016]实施例1
不同浓度药物多柔比星对HepG2细胞毒性的检测 (I)体外培养HepG2细胞分泌蛋白的富集
待体外培养HepG2细胞处于对数分裂期时，弃掉原有细胞培养液，用PBS缓冲液冲洗三次，加入含有0.01yg/mL和0.05 μ g/mL多柔比星但不含双抗和胎牛血清的不完全细胞培养液，培养48h，分别取不同浓度多柔比星作用后的细胞培养液300 yL与-10°C的600yL无水乙醇混合于一1.5mL离心管中，10000 rpm离心8 min，此时分泌蛋白呈白色沉淀在离心管底部，弃上清，用95%的乙醇洗涤一次，离心机中8000rpm离心3 min,去上清，得到沉淀于离心管底部的细胞分泌蛋白，室温下干燥40min，加入12 yL超纯水溶解富集后的细胞分泌蛋白。
[0017](2) HepG2细胞分泌蛋白SERS光谱检测
将SERS增强基底溶胶进行离心浓缩处理，取SERS增强基底浓缩胶体20 μ L与步骤(I)富集的分泌蛋白4 μ L混合均匀后，在光滑平整的检测基底上点样，点样直径为5 _，自然晾干后进行SERS光谱的测量。
[0018](3) H印G2细胞分泌蛋白SERS光谱预处理及特征峰选择
对步骤(2)测量获取的细胞分泌蛋白SERS光谱进行强度归一化处理，从450-1800 cm1波数范围选取I个变化最为显著谱峰作为IfepG2细胞分泌蛋白SERS光谱特征峰。
[0019](4)建立SERS光谱特征峰-细胞存活率标准曲线
利用MTT比色法检测不同浓度多柔比星作用下的HepG2细胞存活率变化，以步骤(3)SERS光谱特征峰的相对强度为纵坐标，MTT比色法测得的细胞存活率为横坐标作图即得标准曲线。最后根据SERS光谱特征峰相对强度在标准曲线上直接查出对应浓度多柔比星作用细胞后细胞的存活率变化。
[0020]实施例2
不同浓度药物顺铂对L02细胞毒性的检测
待体外培养L02细胞处于对数分裂期时，弃掉原有细胞培养液，用PBS缓冲液冲洗三次，加入含有0.01 μ g/mL和0.05 μ g/mL药物但不含双抗和胎牛血清的不完全细胞培养液，培养36 h，分别取不同浓度L02作用后的细胞培养液400 yL与-20°C的800 μ L无水乙醇混合于一 1.5mL离心管中，12000 rpm离心5 min，此时分泌蛋白呈白色沉淀在离心管底部，弃上清，用95%的乙醇洗涤一次，离心机中1000rpm离心I min，去上清，得到沉淀于离心管底部的细胞分泌蛋白，室温下干燥50min，加入18 μ L超纯水溶解富集后的细胞分泌蛋白。
[0021 ] (2 ) L02细胞分泌蛋白SERS光谱检测
将SERS增强基底溶胶进行离心浓缩处理，取SERS增强基底浓缩胶体10 μ L与步骤(I)富集的分泌蛋白2 μ L混合均匀后，在光滑平整的检测基底上点样，点样直径为8 _，自然晾干后进行SERS光谱的测量。
[0022](3) L02细胞分泌蛋白SERS光谱预处理及特征峰选择
对步骤(2)测量获取的细胞分泌蛋白SERS光谱进行强度归一化处理，从400-1750 cm1波数范围选取I个变化最为显著谱峰作为L02细胞分泌蛋白SERS光谱特征峰。
[0023](4)建立SERS光谱特征峰-细胞存活率标准曲线
利用MTT比色法检测不同浓度L02作用下的L02细胞存活率变化，以步骤(3) SERS光谱特征峰的相对强度为纵坐标，MTT比色法测得的细胞存活率为横坐标作图即得标准曲线。最后根据SERS光谱特征峰相对强度在标准曲线上直接查出对应浓度L02作用细胞后细胞的存活率变化。
[0024]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一种利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物细胞毒性方法，其特征在于:先利用乙醇富集经药物作用后的细胞分泌蛋白，再利用SERS光谱技术获取细胞分泌蛋白的SERS光谱，最后结合四唑盐比色法建立细胞分泌蛋白SERS光谱特征峰与细胞存活率标准曲线，从标准曲线中获得不同时间细胞存活率的定量信息，实现SERS光谱对药物细胞毒性的检测。2.根据权利要求1所述的利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物细胞毒性方法，其特征在于:具体包括以下步骤: 1)细胞分泌蛋白的富集 待体外培养细胞处于对数分裂期时，弃掉原有细胞培养液，用PBS缓冲液冲洗三次，加入含有抗癌药物但不含双抗和胎牛血清的不完全细胞培养液，培养l_72h，分别取不同培养时间的细胞培养液200~500 μ L与-20°C -O°C的400-1000 μ L无水乙醇混合于一离心管中，8000-12000 rpm离心5_10min，弃上清液；沉淀用95wt%的乙醇洗涤一次，1000rpm离心2-5 min,弃上清液，得到沉淀于离心管底部的细胞分泌蛋白，室温下干燥30_60min ;然后加入10-20 μ L超纯水溶解干燥后的细胞分泌蛋白，得到细胞分泌蛋白液； 2)SERS光谱检测 将SERS光谱增强基底溶胶进行离心浓缩处理，取SERS光谱增强基底浓缩胶体10-40 μ L与步骤(I)制得的细胞分泌蛋白液2-10 μ L混合均匀后，在光滑平整的检测基底上点样，点样直径为5-8 mm,自然晾干后进行SERS光谱的测量； 3)细胞分泌蛋白SERS光谱预处理及特征峰选择 对步骤(2)测量得到的细胞分泌蛋白SERS光谱进行强度归一化或面积归一化处理，从350-3500cm 1波数范围选取1_3个变化最为显著谱峰作为细胞分泌蛋白SERS光谱特征峰； 4)建立SERS光谱特征峰-细胞存活率标准曲线 利用四唑盐比色法检测对应浓度抗癌药物作用下的细胞存活率变化，以步骤3) SERS光谱特征峰的相对强度为纵坐标，四唑盐比色法测得的细胞存活率为横坐标作图即得标准曲线；最后根据SERS光谱特征峰相对强度在标准曲线上直接查出相应浓度抗癌药物作用细胞后细胞的存活率变化。3.根据权利要求2所述的利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物对细胞毒性的方法，其特征在于:步骤2)所述SERS光谱增强基底溶胶为银溶胶或金溶胶中的一种。4.根据权利要求2所述的利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物对细胞毒性的方法，其特征在于:步骤2)所述的离心浓缩处理为:离心转速为8000-12000rpm，时间为8_15 min。5.根据权利要求2所述的利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物对细胞毒性的方法，其特征在于:步骤2)所述的检测基底为99.99%铝片、石英基底、不锈钢基底、金箔、MgF2、CaF2、银箔中的一种。6.根据权利要求2所述的利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物对细胞毒性的方法，其特征在于:步骤2)所述的SERS光谱的测量其条件为:激光功率为0.15 -18 mW，激光激发波长为400~900 nm，取谱范围为350-3500 cm1。7.根据权利要求2所述的利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物对细胞毒性的方法，其特征在于:步骤3)所述的细胞分泌蛋白SERS光谱特征峰为药物作用细胞前后同一细胞分泌蛋白SERS光谱峰的相对强度出现明显变化的SERS光谱峰。
【专利摘要】本发明属于抗癌药物对细胞毒性的检测领域，具体涉及一种利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物细胞毒性方法。先利用乙醇富集经药物作用后的细胞分泌蛋白，再利用SERS光谱技术获取细胞分泌蛋白的SERS光谱，最后结合四唑盐比色法建立细胞分泌蛋白SERS光谱特征峰与细胞存活率标准曲线，从标准曲线中获得不同时间细胞存活率的定量信息，实现SERS光谱对药物细胞毒性的检测。通过测量细胞分泌蛋白的SERS光谱，可实现药物对细胞毒性的检测，对进一步研究分泌蛋白的相关生物学机制具有潜在学术和应用价值。
【IPC分类】G01N21/65
【公开号】CN105181670
【申请号】CN201510529521
【发明人】林居强, 杨洪钦, 阮秋咏, 王瑜华, 徐朝贤, 陈荣, 谢树森
【申请人】福建师范大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月26日