荧光定量联合检测弓形虫IgG、IgM抗体试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫分析领域，尤其是涉及一种荧光定量联合检测弓形虫IgG、IgM抗 体试剂盒。
【背景技术】
[0002] 弓形虫（Toxoplasma gondii，Τ0Χ)是寄生于人和哺乳动物组织细胞内的机会性致 病原虫，它引起的弓形体病（toxoplasmpsis)是一种人畜共患病，广泛流行于世界各地。人 感染弓形虫后可侵犯多种脏器，其临床表现因侵犯脏器不同而异，孕妇感染弓形虫可能会 对胎儿造成严重后果。一般在怀孕的前3个月胎儿的感染率较低(约17%)，最常见的是流 产，很少对胎儿造成严重伤害，第4-6个月感染会对胎儿造成中级或严重的伤害，妊娠后期 感染时弓形虫易于通过胎盘，感染率较高(约64%)，但此时胎儿抵抗力较高，损害则较轻。感 染婴儿有的出生时症状并不明显，以后才逐渐出现，先天性患者以中枢神经系统和眼症状 为多见。另外当机体出现免疫抑制后，潜伏期感染会被激活，在艾滋病人群中，弓形虫脑炎 已成为最关键的、也是最终的致死病因。
[0003] 直接取患者的体液或组织样本做瑞氏或姬氏染色镜检可找到弓形虫滋养体或包 囊，但阳性率不高，也可作直接免疫荧光法检查组织内弓形虫。循环抗原（CAg)为弓形虫在 宿主内增殖过程中的代谢和裂解物，在弓形虫感染早期、急性期或活动期的血清及体液中 有较高的含量，因此，CAg抗原的检测可作为弓形虫现症感染的辅助诊断方法，但是弓形虫 病的虫血症短暂，所以检测抗原血症的实用性有待研究。相比之下IgM和IgG抗体的检测 是目前普及的主要方法，IgM抗体一般在感染1周后出现，4~8周逐渐消失，是近期感染的 指标，IgG抗体一般在感染2周后出现，可持续多年，是既往感染的指标。
[0004] 目前，弓形虫IgG、IgM抗体检测有免疫荧光法、ELISA法、胶体金法等技术。免疫 荧光法需要荧光显微镜，检测价格昂贵、费时；ELISA法需要专用设备，反应时间比较长，检 测步骤繁杂；胶体金法灵敏度和特异性较低，应用受到限制。量子点是一种直径在1~1〇〇 nm之间，能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒，具有宽激发、窄发射、发射峰可调以 及荧光寿命长等优良特性。近年来，在医学、生物学领域，人们集中研究用量子点代替传统 的化学荧光标记物用于免疫学检测。根据量子点的这些光学特点，以其标记单克隆抗体建 立免疫吸附技术来定量检测病原体，将大大提高检测方法的灵敏度和特异性，比较适合基 层医院、社区医疗服务站、临床科室、门诊等即时检测。但截至目前，利用荧光量子点标记技 术针对弓形虫IgG、IgM抗体进行快速定量检测的试剂盒在我国还是空白。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种检测灵敏度高、特异性好且检测过程快速简单、不需 要复杂仪器的荧光定量联合检测弓形虫IgG、IgM抗体试剂盒。
[0006] 为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案： 本发明所述的荧光定量联合检测弓形虫IgG、IgM抗体试剂盒，包括试纸条、量子点标 记液；所述试纸条由按次序粘贴在衬板上的吸水纸、硝酸纤维素膜和样品垫构成，所述硝酸 纤维素膜检测线T1和检测线T2上分别包被有弓形虫抗原，质控线C上包被有羊抗鼠 IgG多 抗；所述量子点标记液是量子点标记的鼠抗人IgG抗体及量子点标记的鼠抗人IgM( μ链） 抗体的混合溶液。
[0007] 所述硝酸纤维素膜检测线1\和检测线T 2上包被的为弓形虫抗原SAGl和SAG2,其 浓度为〇· 5~0· 8mg/ml、包被量为L 0 μ 1/cm。
[0008] 所述硝酸纤维素膜质控线C上包被的羊抗鼠IgG多抗的浓度为L 0~L 5mg/ml、 包被量1. 〇 μ 1/cm。
[0009] 所述量子点为5~20nm的微球，量子点表面的活性基团为-COOH或-NH2,激发波 长300~330nm，发射峰位400~620nm。
[0010] 所述的量子点标记液采用1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC) 与N-羟基丁二酰亚胺（NHS)共价交联方式标记鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM( μ链）抗体 的混合溶液。
[0011] 所述量子点标记的鼠抗人IgG抗体标记浓度为5~10 μ g/ml。
[0012] 所述量子点标记的鼠抗人IgM( μ链）抗体标记浓度为5~10 μ g/ml。
[0013] 本发明采用免疫层析荧光定量检测技术，利用量子点标记的鼠抗人IgG抗体和鼠 抗人IgM(y链）抗体与样本中弓形虫IgG抗体、IgM抗体充分结合，然后再分别与硝酸纤 维素膜检测线T1和检测线T2包被的分别被不同位点的弓形虫抗原发生特异性结合（SAGl 被弓形虫IgG抗体特异性识别、SAG2被IgM抗体特异性识别），可以有效区分弓形虫既往感 染和/或近期感染状态，弥补了我国对弓形虫IgG、IgM抗体的快速定量检测，满足了基层医 院、社区医疗服务站、临床科室、门诊等对弓形虫IgG、IgM抗体的即时检测。
【附图说明】
[0014] 图1是本发明试剂盒中试纸条的结构示意图。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合【具体实施方式】对本发明做更加详细的阐述。
[0016] 本发明所述的荧光定量联合检测弓形虫IgG、IgM抗体试剂盒，包括试纸条、量子 点标记液；如图1所示，试纸条由按次序粘贴在PVC衬板1上的吸水纸2、硝酸纤维素膜3和 样品垫4构成，硝酸纤维素膜检测线T1 5和检测线T2 6上分别包被有弓形虫抗原，质控线C 7上包被有羊抗鼠 IgG多抗；量子点标记液是量子点标记的鼠抗人IgG抗体及量子点标记 的鼠抗人IgMU链）抗体的混合溶液。
[0017] -、本发明试剂盒的制备方法为： 1、硝酸纤维素膜检测线T1、检测线T2和质控线C包被 将弓形虫抗原SAGl用pH8. 0、0.0 lM的TBS缓冲液稀释至0. 5~0. 8mg/ml，作为检测线 !\的包被液，将弓形虫抗原SAG2用pH8. 0、0.0 lM的TBS缓冲液稀释至0. 5~0. 8mg/ml，作 为检测线T2的包被液，羊抗鼠 IgG多抗用pH7. 5、0.0 lM的PBS缓冲液稀释至I. 0~I. 5mg/ ml，作为质控线C的包被液；使用试纸条专用三线划膜仪将检测线TUT2的包被液和质控线 C的包被液分别包被到贴在PVC衬板上的硝酸纤维素膜上，置于恒温干燥箱37