一种定性检测负载在多糖微球中功能纳米颗粒分布的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米材料生物应用技术领域，涉及一种定性检测负载在多糖微球中功能纳米颗粒分布的方法。
【背景技术】
[0002]功能纳米颗粒是指具有特定的功能，如Fe3O4纳米颗粒等，具有独特的磁响应性能，能够对外加磁信号做出迅速地磁响应，在磁热治疗肿瘤、药物靶向输送及刺激-响应性控制释放等方面具有广泛的应用。近年来，药物载体的发展，又为纳米颗粒的广泛应用提供了广阔的发展空间，通过药物载体包覆磁性Fe3O4纳米颗粒，既可显著提高纳米颗粒的生物相容性，又可利用纳米颗粒的磁学性能，显著提高药物的利用率，具有重要的应用意义。
[0003]材料是决定药物载体特性的关键因素，一般，药物载体材料均需具备成膜性好，与包封物不发生反应，生物相容性好和可降解性良好等特性。海藻酸钠、壳聚糖因其资源丰富、制备简单、价格便宜等优点，同时，海藻酸钠-壳聚糖形成的天然多糖水凝胶球具有三维网状空间结构，可以大量负载纳米颗粒和抗肿瘤药物，因此，在药物载体的应用上受到广泛关注。
[0004]目前，制备水凝胶微球的工艺主要有乳化法、界面聚合法、相分离法、喷雾干燥法和静电液滴法等。而静电液滴法是将电场力作用于微流动过程，使溶液形成直径远小于喷嘴尺寸的高速射流并断裂形成带电液滴，液滴在固化过程中因携带同性电荷产生排斥作用而使微球具有优异的自发单分散性。微球制备过程温和，操作简单，微球粒径可控，形貌良好，包封率高，具有广阔的应用前景。
[0005]然而，磁性Fe3O4纳米颗粒包封入药物载体后，其在载体内部的分布及对药物载体结构的影响，将直接影响到纳米颗粒的磁学性能及其在药物载体方面的应用。人们尝试各种方法对纳米颗粒进行标记，以观测其在药物载体内部的分布，但其过程复杂，并且由于荧光共振能量转移，容易引起荧光淬灭，使其在生物医学方面受到限制。
【发明内容】
[0006]为解决上述问题，本发明提供了一种定性检测负载在多糖微球中功能纳米颗粒分布的方法。
[0007]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:
[0008]S1、将异硫氰酸荧光素标记的磁性Fe3O4纳米颗粒加入到浓度为1_2%的海藻酸钠水溶液中，搅拌均匀，得浓度为0.2?1.0mgFe/mL的混合液；
[0009]S2、用静电脉冲液滴法将所得的混合液滴入浓度为1-2 %的CaCl2水溶液中，静电场电压为350V，频率为400Hz，金属喷嘴直径500 μ m，液面距2cm，Ih后滴加完毕，静置30min，用去离子水冲洗三次，去除凝胶球表面多余的Ca2+离子，过150目的筛网筛选微球尺寸，得载Fe3O4-AED-FITC海藻酸盐凝胶球；
[0010]S3、将所得载Fe3O4-AED-FITC海藻酸盐凝胶球用壳聚糖的醋酸溶液覆膜30_40min后，去离子水冲洗三次，得包覆有Fe3O4-FITC的AC微球(海藻酸盐-壳聚糖微球)；
[0011]S4、将所得的包覆有Fe3O4-FITC的AC微球置于荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下，波长为488nm下进行激发，观察绿色荧光亮点的分布，即为功能纳米颗粒在多糖微球内部的分布。
[0012]其中，步骤S1-S4均在避光条件下完成。
[0013]其中，所述的异硫氰酸荧光素标记的磁性Fe3O4纳米颗粒通过以下步骤制备:
[0014]步骤一、将水溶性的Fe3O4纳米颗粒，溶解到2- (N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液进行活化15-30min，EDC和NHS的质量比(g/g)为2: 3-2: 5，EDC和羧基的摩尔比为1: 3?1: 6;
[0015]步骤二、将溶解有胱胺的pH = 7.4的PBS水溶液加入到上述溶液中，羧基和胱胺的摩尔比为1: 3?1: 5，于摇床(250r/min)上反应2_4h ；
[0016]步骤三、反应结束后，通过磁分离法，将纳米颗粒从溶液中析出，用去离子水洗涤颗粒三次，得Fe3O4-AED13将所得的Fe3O4-AED溶于去离子水，用0.5mol/L的NaOH调节pH至8.8，得溶液A ;
[0017]步骤四、将Img异硫氰酸焚光素溶解于ImL 二甲基亚砜中，用pH = 7.4的PBS磷酸盐缓冲溶液稀释至浓度为50 μ g/mL后，与溶液A混合，荧光素与伯氨基的摩尔比为1: 60?1: 100，室温下，于150r/min的摇床上反应4h，反应结束后，依照步骤三进行磁分离，用乙醇洗涤三次，得Fe3O4-AED-FITC13
[0018]其中，所述的Fe3O4纳米颗粒的粒径为3?lOOnm。
[0019]其中，脉冲电场液滴法所采用的金属喷嘴直径为500 μ m。
[0020]其中，所述的纳米颗粒为表面含有羧基的功能纳米颗粒。
[0021]其中，所述的功能纳米颗粒为量子点CdS、CdSe, CdTe或ZnSe、Fe3O4或MFe 204,其中，M为金属Mn、Zn、Co或Ni。
[0022]其中，用壳聚糖对凝胶球继续覆膜时，凝胶球和壳聚糖溶液的体积比为1: 4。
[0023]本发明具有以下有益效果:
[0024]采用FITC标记Fe3O4纳米颗粒，通过胱胺对Fe 304纳米颗粒进行表面修饰，为下一步接枝FITC提供反应氨基。与现有技术相比，本发明的接枝效率高，且反应产物稳定，易于保存，不易因能量共振转移而发生荧光淬灭现象。所采用的药物载体材料为海藻酸盐/壳聚糖(AC)微球，该微球具有三维网状空间结构，可以大量负载纳米颗粒和抗肿瘤药物，具有包封率高等优点，为药物载体的发展提供了广大的发展空间。
【附图说明】
[0025]图1A本发明实施例1的19nm水溶性Fe3O4纳米颗粒的TEM图。
[0026]图1B本发明实施例1的19nm水溶性Fe3O4纳米颗粒的动态光散射表征。
[0027]图1C本发明实施例1的Fe3O4纳米颗粒及Fe 304_AED的FTIR图。
[0028]图2本发明实施例2的Fe3O4-AED及Fe3O4-AED-FITC的紫外可见吸收光谱图。
[0029]图3A和3B本发明实施例3的浓度为0.38mg Fe/mL的载Fe3O4-AED-FITC的AC微球的显微镜照片和微球的粒径分布图。
[0030]图3C本发明实施例3的浓度为0.38mg Fe/mL的载Fe3O4-AED-FITC的AC荧光显微镜照片。
[0031]图3D本发明实施例3的浓度为0.38mg Fe/mL的载Fe3O4-AED-FITC的AC微球的激光共聚焦显微镜照片。
[0032]图4A本发明实施例4的浓度为0.80mg Fe/mL的载Fe3O4-AED-FITC的AC微球激光共聚焦显微镜照片。
[0033]图4B本发明实施例4的浓度为0.80mg Fe/mL的载Fe3O4-AED-FITC的AC微球的z轴分布激光共聚焦显微镜照片。
[0034]图5为本发明实施例中异硫氰酸荧光素(FITC)标记的磁性Fe3O4纳米颗粒(Fe3O4-AED-FITC)的制备流程图。
【具体实施方式】
[0035]为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0036]实施例1
[0037]用胱胺修饰Fe3O4纳米颗粒的方法:
[0038]19nm Fe3O4纳米颗粒的制备参考文献:Nature Materials.2004，3，891-895。
[0039]油相纳米颗粒的转水参考文献:西安金磁纳米生物技术有限公司，文件编号GMAG-Q1-PD-020。
[0040]将5mL溶解有19nm的Fe3O4纳米颗粒(含羧基浓度为0.03mmol/mL)的MES缓冲溶液于50mL塑料离心管中(pH = 6)，加入0.5mL EDC水溶液(浓度为2mmol/mL)，于150r/min的摇床上，振荡15min ;加入0.5mL NHS水溶液(浓度为10mmol/mL)于上述溶液中；继而加入25mL含胱胺(浓度为0.03mmol/mL)的PBS缓冲溶液(pH = 7.4)，于150r/min的摇床上进行反应，2h后终止反应，通过磁分离法，将纳米颗粒从溶液中析出，用去离子水洗涤颗，重复上述操作三次，最终的反应产物(Fe3O4-AED)溶解在2mL去离子水中。
[0041]将大约15uL的分散有19nm Fe3O4纳米颗粒的水溶液滴在镀有碳膜的Cu网上，自然干燥后，做透射电镜，如图1A所示。
[0042]取I ?1.5mL Fe3O4纳米颗粒的水溶液，使用 Malvern Nano Zeta Sizer Analyzer进行光散射测试水化半径，从图1B中可知19nm Fe3O4纳米颗粒分散在水溶液后平均水化半径为 113.8nm。
[0043]将2mL Fe3O4纳米颗粒的水溶液及接枝有胱胺的Fe 304纳米颗粒(Fe3O4-AED)的水溶液在真空干燥箱中30°C下，真空干燥12h，待成为固体粉末后，用傅里叶变换红外光谱(FTIR)进行表征，结果如图1C所示，可以看到Fe3O4-COOH纳米颗粒在波数为1588cm 1位置出现-COOH峰，在波数为593cm 1的位置出现Fe-O峰；在接枝胱胺后的Fe 304_AED纳米颗粒在波数为1632cm 1位置出现-CO-NH-峰，在波数为3272cm 1位置出现-NH 2峰，说明胱胺的成功接枝，并且有游离的氨基，以利于下一步与FITC反应。
[0044]实施例2
[0045]标记有FITC 的 Fe3O4-AED-FITC 的制备:
[0046]将Img异硫氰酸荧光素(FITC)溶解于ImL 二甲基亚砜(DMSO)中，用pH = 7.4的PBS磷酸盐缓冲溶液稀释至浓度为50 μ g/mL ;将该溶液加入