到含Fe3O4-AED的20mL水溶液中(含氨基0.17臟01，用0.511101/1的他0!1调节？!1至8.8)，荧光素与伯氨基的摩尔比为I: 60?1: 100，室温下，于150r/min的摇床上进行反应4h。反应结束后，通过磁分离法，将纳米颗粒从溶液中析出，用去乙醇洗涤颗粒，重复此操作三次，最终产物Fe3O4-AED-FITC存放于PBS缓冲溶液中，4°C下避光保存。
[0047]反应产物Fe3O4-AED-FITC浓度的测定:移取200 μ L上述含Fe3O4-FITC的PBS缓冲溶液，加入ImL次氯酸，3mL硝酸，130°C下进行硝解3?4h，静置一夜后，转入1mL容量瓶中，加入去离子水定容，用电感親合等离子体(Inductively Coupled Plasma, ICP)测该水溶液中铁离子的含量。
[0048]取I?1.5mL Fe3O4-AED和Fe3O4-AED-FITC的水溶液，使用紫外可见吸收光谱(UV-Vis Absorpt1n spectrum)进行FITC的峰位测试，如图2所示，通过两条曲线的对比，可以明显看出接枝FITC后的纳米颗粒在波数为503nm的位置出现FITC的吸收峰，证明了FITC的成功接枝；在波数为224nm位置出现的峰位胱胺中双硫键的特征吸收峰。
[0049]实施例3
[0050]载铁量为0.38mg Fe/mL的AC微球的制备:
[0051 ] 用实施例1的方法制备Fe3O4-AED-FITC纳米颗粒水溶液。
[0052]将含铁量为3mg的Fe3O4-AED-FITC溶解于0.5mL去离子水中，与海藻酸钠水溶液混合均匀，混合后，Fe3O4-FITC的浓度为0.6mg Fe/mL，海藻酸钠的浓度为1.2%, w/v ;用静电场脉冲液滴法将海藻酸钠水溶液滴入CaCl2水溶液(浓度为2 %，w/v)中，形成水凝胶微球，静电场电压为350V，频率为400Hz，金属喷嘴直径500 μπι，液面距2cm ;lh后滴加完毕，静置30min，用去离子水冲洗三次去除多余的Ca2+离子，用150目的筛网筛选微球尺寸；加入壳聚糖(0.5%，w/v)的醋酸(2%，v/v)溶液进行覆膜，凝胶球和壳聚糖溶液的体积比为I: 4，30min，用去离子水冲洗三次，即得包覆有Fe3O4-FITC的AC微球。
[0053]破囊液的配制:破囊液的基本组成为0.2mol/L的NaHCOjP 0.06mol/L的柠檬酸钠(Na3C6H5O7.12H20)水溶液，pH = 7.8 ?8.2。
[0054]取0.5mL AC微球，将破囊液和AC微球以体积比10: I混合，手动振摇，微囊在30s内全部溶解。在破囊后的溶液中加入ImL次氯酸和3mL硝酸，130°C下进行硝解7?8h，用ICP测试溶液中Fe的含量。通过计算，该微球具有较高的包封率，达到59.7%。
[0055]取I?1.5mL AC微球的水溶液，使用荧光显微镜和Olympus Fluoview FV1000激光共聚焦显微镜进行荧光表征。
[0056]图3A和3B为载Fe3O4-AED-FITC的AC微球照片与浓度为0.38mg Fe/mL的载Fe3O4-AED-FITC的AC微球普通显微镜照片及粒径分布图。从图中可以看出，该微球的粒径分布范围较窄，平均粒径为428 μ m。图3C和3D为浓度为0.38mg Fe/mL载Fe3O4-FITC的AC微球的荧光显微镜照片和激光共聚焦显微镜照片，从两个图中可以看出，发绿光的部位即为FITC标记的Fe3O4纳米颗粒的部位，Fe 304纳米颗粒的中心和边缘均有分布且分布比较均匀。
[0057]实施例4
[0058]载铁量为0.80mg Fe/mL的AC微球的制备:
[0059]将含铁量为6.5mg的Fe3O4-FITC溶解于0.5mL去离子水中，与海藻酸钠水溶液(浓度为1.2%,w/v)混合均匀，Fe3O4-FITC的浓度为1.3mg Fe/mL ;用静电场脉冲液滴法将海藻酸钠水溶液滴入CaCl2水溶液(浓度为2 %，w/v)中，形成水凝胶微球，静电场电压为300V，频率为400Hz，金属喷嘴直径500 μ m，液面距2cm ;lh后滴加完毕，静置30min，用去离子水冲洗三次去除多余的Ca2+离子，用150目的筛网筛选微球尺寸；加入壳聚糖(0.5%,w/v)的醋酸(2%，v/v)溶液进行覆膜，凝胶球和壳聚糖溶液的体积比为1: 4，30min，用去离子水冲洗三次，即得包覆有Fe3O4-FITC的AC微球。
[0060]使用实例3中的破囊液进行破囊，用ICP测试Fe的浓度，通过计算，该微球的包封率为50.0%。
[0061]取I?1.5mL AC微球的水溶液，使用荧光显微镜和Olympus Fluoview FVlOOO激光共聚焦显微镜进行荧光表征。
[0062]图4A为浓度为0.80mg Fe/mL的载Fe3O4-AED-FITC的AC微球激光共聚焦显微镜照片，和图3D相比，该微球中的绿光密度比较大，说明该微球中Fe3O4纳米颗粒的浓度比较大。
[0063]图4B为浓度为0.80mg Fe/mL的载Fe3O4-AED-FITC的AC微球的z轴分布激光共聚焦显微镜照片，从图中可以看出从该微球的顶部到底部，绿光密度由小到大到小，此图可以清晰的看到Fe3O4纳米颗粒在微球内部的分布。
[0064]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种定性检测负载在多糖微球中功能纳米颗粒分布的方法，其特征在于，包括以下步骤: 51、将异硫氰酸荧光素标记的磁性Fe3O4纳米颗粒加入到浓度为1-2%的海藻酸钠水溶液中，搅拌均匀，得浓度为0.2?1.0mgFe/mL的混合液； 52、用静电脉冲液滴法将所得的混合液滴入浓度为1-2%的CaCl2水溶液中，静电场电压为350V，频率为400Hz，金属喷嘴直径500 μ m，液面距2cm，Ih后滴加完毕，静置30min，用去离子水冲洗三次，去除凝胶球表面多余的Ca2+离子，过150目的筛网筛选微球尺寸，得载Fe3O4-AED-FITC海藻酸盐凝胶球； 53、将所得载Fe3O4-AED-FITC海藻酸盐凝胶球用壳聚糖的醋酸溶液覆膜30_40min后，去离子水冲洗三次，得包覆有Fe3O4-FITC的AC微球； 54、将所得的包覆有Fe3O4-FITC的AC微球置于荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下，波长为488nm下进行激发，观察绿色荧光亮点的分布，即为功能纳米颗粒在多糖微球内部的分布O2.根据权利要求1所述的一种定性检测负载在多糖微球中功能纳米颗粒分布的方法，其特征在于，步骤S1-S4均在避光条件下完成。3.根据权利要求1所述的一种定性检测负载在多糖微球中功能纳米颗粒分布的方法，其特征在于，所述的异硫氰酸荧光素标记的磁性Fe3O4纳米颗粒通过以下步骤制备: 步骤一、将水溶性的Fe3O4纳米颗粒，溶解到2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液中，加入1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺水溶液进行活化15-30min，EDC和NHS的质量比为2: 3-2: 5，EDC和羧基的摩尔比为1: 3?1: 6; 步骤二、将溶解有胱胺的pH = 7.4的PBS水溶液加入到上述溶液中，羧基和胱胺的摩尔比为1: 3?1: 5，于摇床，250r/min反应2-4h ; 步骤三、反应结束后，通过磁分离法，将纳米颗粒从溶液中析出，用去离子水洗涤颗粒三次，得Fe3O4-AED,将所得的Fe3O4-AED溶于去离子水，用0.5mol/L的NaCH调节pH至8.8，得溶液A ; 步骤四、将Img异硫氰酸荧光素溶解于ImL 二甲基亚砜中，用pH = 7.4的PBS磷酸盐缓冲溶液稀释至浓度为50 μ g/mL后，与溶液A混合，荧光素与伯氨基的摩尔比为1: 60?I: 100，室温下，于150r/min的摇床上反应4h，反应结束后，依照步骤三进行磁分离，用乙醇洗涤三次，得Fe3O4-AED-FITC134.根据权利要求3所述的一种定性检测负载在多糖微球中功能纳米颗粒分布的方法，其特征在于，所述的Fe3O4纳米颗粒的粒径为3?lOOnm。5.根据权利要求3所述的一种定性检测负载在多糖微球中功能纳米颗粒分布的方法，其特征在于，脉冲电场液滴法所采用的金属喷嘴直径为500 μ m。6.根据权利要求3所述的一种定性检测负载在多糖微球中功能纳米颗粒分布的方法，其特征在于，所述的纳米颗粒为表面含有羧基的功能纳米颗粒。7.根据权利要求6所述的一种定性检测负载在多糖微球中功能纳米颗粒分布的方法，其特征在于，所述的功能纳米颗粒为量子点CdS、CdSe, CdTe或ZnSe、Fe3O4或MFe 204，其中，M为金属Mn、Zn、Co或Ni。8.根据权利要求3所述的一种定性检测负载在多糖微球中功能纳米颗粒分布的方法，其特征在于，用壳聚糖对凝胶球继续覆膜时，凝胶球和壳聚糖溶液的体积比为1: 4。
【专利摘要】本发明公开了一种定性检测负载在多糖微球中功能纳米颗粒分布的方法，具体涉及用多糖微球包覆异硫氰酸荧光素(FITC)标记的功能纳米颗粒，通过荧光显微镜和激光共聚焦显微镜在波长为488nm下进行激发，荧光素发出绿光，从而判断纳米颗粒在多糖微球内的分布。由于FITC与特定氨基官能团进行反应，通过使用两端有伯氨基的胱胺对表面有羧基的纳米颗粒进行修饰，从而提供与FITC反应的反应基团，实现了FITC对功能纳米颗粒的标记。本发明制备过程简单，反应条件温和，稳定性好，易于保存，生物相容性好，实现了对纳米颗粒在药物载体内分布的直观检测，可广泛应用于纳米材料的生物应用领域。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN105181662
【申请号】CN201510540038
【发明人】薛伟明, 马何平, 樊海明
【申请人】西北大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月24日