发光聚合物循环扩增的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种在液体试样中利用一个具有小表面积的探针和一个具有多个结 合分子和多个荧光或化学发光法标记的支化聚合物以探测被分析物的方法。这个方法的敏 感性是通过多次循环结合反应和扩增反应来提高的。
【背景技术】
[0002] 在许多免疫分析应用中需要发展高灵敏度的测定方法。发光染料，发射荧光或化 学发光信号，提供了若干实用性的优点，例如：稳定性，低成本，适合于标记步骤和最小限度 的受生物试样或固相底物干扰的光谱性质。与其他测定方法相比，荧光染料法有一个缺点， 特别是ELISA，其酶活力扩增了与免疫复合物结构相关的可测信号的总量。
[0003] 芳基磺酸酯花青焚光染料被描述于Mujumdar等（1993) Bioconjugate Chemistry，4:105_lll;Southwick 等（1990)Cytometry，11 :418-430;和美国专利 号5,268,486。每一篇参考文献都描述了 Cy5,并且其可以从宾夕法尼亚州匹兹堡的 Biological Detection Systems公司买到，商品名为FLU0R0LINK?Cy5?。该芳基横酸酯花 青荧光染料具有高消光系数（通常为130, 000升/摩尔至250, 000升/摩尔），优良的量子 产率，在大多数生物材料和塑料的自体荧光波长范围以外（500纳米至750纳米）的荧光发 射谱，优良的溶解性，以及低非特异性结合特性。
[0004] 尽管有这些优异性能，芳基磺酸酯花青荧光染料也存在某些限制。特别是，这些染 料的斯托克斯频移相对较窄，其导致该染料的激发和发射谱之间的明显重叠。当这些染料 分子在受激发时彼此位置接近时，该激发和发射谱的重叠可以引起荧光的自熄灭。这种自 熄灭限制了可以结合至单个抗体分子用于免疫分析的芳基磺酸酯染料分子的数目。在示范 性的芳基磺酸酯花青荧光染料Cy5的情况下，斯托克斯频移是17纳米（其为650纳米的激 发波长和667纳米的发射波长之差）。当两至四个Cy5分子被结合至单个抗体分子时，获得 最佳的荧光产率。当超过四个染料分子被结合至单一抗体分子时，该荧光信号输出迅速下 降。这种不能结合超过四个染料分子至单一的抗体分子的特性明显限制了使用Cy5-标记 的抗体及其它结合物质的免疫分析的灵敏度。
[0005] 美国公开2001/0312105公开了一个探测系统和荧光免疫分析；该公开的整体以 参考方式被合并于此。该公开没有公开通过探针在试剂容器和扩增容器来回地循环得到扩 增。
[0006] 需要有改善的方法，用于通过荧光或化学发光法免疫分析以高灵敏度检测被分析 物。该方法应易于由用户操作，并应提供高特异性的信号和最小的背景噪声。
【发明内容】
[0007] 本发明涉及用于探测在液体试样中具有高敏感性的被分析物的发光免疫分析方 法。该方法包括步骤：(a)获得一探针，其具有被固定在该探针梢端上的第一抗体；(b)将该 探针梢端浸入包含具有被分析物的样品溶液的样品容器中，将被分析物与在探针梢端的第 一抗体结合；（C)将该探针梢端浸入包含试剂溶液的试剂容器，该试剂溶液包括和一结合 配对的第一成员结合的第二抗体分子试剂以结合该试剂和被分析物；（d)将该探针梢端浸 入含洗液的洗涤容器中来洗涤探针梢端；（e)将该探针梢端浸入含有扩增溶液的扩增容器 中，该扩增溶液中含有一聚合物，该聚合物结合有至少5个分子的该结合配对的第二成员 和至少25个荧光标记，以在该探针梢端上形成该被分析物，该第一抗体，该第二抗体，和该 结合配对的第一和第二成员间的免疫复合体，其中该聚合物是分支的，并且其分子量至少 为约一百万道尔顿，发光标记的分子质量小于2000道尔顿；（f)将该探针梢端浸入含第二 洗液的第二洗涤容器以洗涤探针梢端；（g)重复步骤（c)至（f) 1-10次，以及（g)通过测定 在探针梢端的发光信号来探测免疫复合物。
[0008] 本发明还涉及到一个组合物，包括（a)具有分子量至少一百万道尔顿的支化聚合 物，（b)至少5个结合分子，并且（c)至少25个选自三（双吡啶）合^!了（II) (ruthenium(II) tris-bipyridine)，鲁米诺，叮啶酯，和氯化血红素的化学发光分子；其中结合分子和化学 发光分子被结合到聚合物上。
【附图说明】
[0009] 图1显示了用于探测探针传感表面的荧光信号的光学探测系统。
[0010] 图2显示了用于探测在探针梢端的化学发光信号的电化学发光探测系统。
[0011] 图3显示了用于检测抗原被分析物的免疫分析形式。Ab :抗体，Ag :抗原，Sa :链霉 亲和素 ，B :生物素 ，F :荧光标记。
[0012] 图4显示了在循环扩增中的探针转移。
[0013] 图5显示了制备交联ficoll 400-SPDP的流程图。
[0014] 详细说明
[0015] 定义
[0016] 除非在下文定义，权利要求和说明书中使用的术语将根据本领域技术人员所理解 的通常含义进行解释。
[0017] 此处使用的"约"指在所列举值的± 10%以内。
[0018] 此处使用的"结合被分析物的分子"指能参与和被分析物分子的特异性结合反应 的任何分子。
[0019] 形状的"纵横比"指其较长尺寸与其较短尺寸的比率。
[0020] "结合分子"指能够结合另一个感兴趣的分子的分子。
[0021] 此处使用的"结合配对"指彼此吸引并特异性结合的两个分子。结合配对的例子 包括，但不限于，抗原和针对该抗原的抗体，配位体及其受体，核酸的互补链，生物素和抗生 物素蛋白（avidin)，生物素和链霉亲和素，生物素和亲和素（neutravidin)(去糖基化的版 本的抗生物素蛋白（avidin))，凝集素和糖类。优选的结合配对是生物素和链霉亲和素，生 物素和抗生物素蛋白（avidin)，生物素和亲和素（neutravidin)，荧光素和抗荧光素，异羟 基洋地黄毒苷/抗异羟基洋地黄毒苷（digioxigenin/anti-digioxigenin)，DNP (二硝基苯 酚）和抗-DNP。
[0022] 此处使用的"支化聚合物"指一个非线性聚合物，其具有二或三维结构，其可能是 天然存在的支化聚合物，或一个合成交联聚合物。
[0023] 此处使用的"化学发光"指能量的释放伴随有限的冷光的释放，是一个化学反应的 结果。例如，当鲁米诺在有合适催化剂时与过氧化氢反应，产生处于激活态的3-氨基邻苯 二甲酸盐，它在衰变到低能量级时发光。
[0024] 此处使用的"树状聚合物"指重复的有机的支化分子。一个树状聚合物一般对称 地环绕于核心，且通常采取球状三维结构。
[0025] 此处使用的"电化学发光"(ECL)指在溶液中的电化学反应中产生的冷光。在电化 学发光中，电化学产生的中间体经过一个高放能反应产生一个电子激活态，然后发光。ECL 激发是由电子产生的物质经高能电子转移反应（氧化还原反应）引起的。ECL通常可以通 过向含有发光物质溶液的电化学电池的电极施加电位（若干伏特）观察到。
[0026] 此处使用的"被固定"指试剂被固定在固体表面上。当试剂被固定至固体表面时， 其可以被非共价或共价地结合至该表面。
[0027] 此处使用的"整体式衬底"指具有一个折射指数的单块固体材料。
[0028] 此处使用的"探针"指在传感侧包覆有被分析物结合分子的薄膜层的衬底。探针 具有远端和近端。该近端（在此申请中也称为探针梢端）具有用被分析物结合分子的薄层 包覆的传感表面。
[0029] 高敏感度发光免疫分析
[0030] 本发明涉及一个高敏感度免疫分析方法。发明人已经发现，一个独特的组合（i) 利用具有晓得传感表面积用以结合被分析物分子的探针，（ii)利用一个与复合分子和复合 发光标记结合的高分子量的支化聚合物，并且（iii)具有免疫复合物结构的探针循环地返 回试剂容器和扩增容器1-10次并且与试剂和扩增聚合物重复反应，改善探测水平的敏感 度。本发明涉及一个高敏感度免疫分析方法。发明人已经发现，（i)利用具有小的用以结 合被分析物分子的传感表面积的探针，（ii)利用一个与多个结合分子和多个发光标记结合 的高分子量的支化聚合物，以及（iii)将具有形成的免疫复合物的探针循环地返回试剂容 器和扩增容器1-10次并且重复与试剂和扩增聚合物的反应的独特组合，改进了探测水平 的敏感度。对每个循环，发光信号比噪音提高显著。
[0031] 本方法提供了高灵敏度和精密度而不增加分析试剂，消耗品和测量仪器整体的复 杂度。本方法要求探针反复地在两个试剂间转移，其中一个是带有多个结合分子和多个发 光标记的扩增聚合物。聚合物具有分子量多400K，优选多一百万道尔顿。聚合物的交联希 望能控制分子大小的分布和非特异性结合。聚合物应携带最少5个结合分子每个聚合物， 优选大于10个。发光标记应较小，其分子量<5K道尔顿。发明人已经发现不用如上所述 在扩增中的聚合物而简单地循环反应没有提高灵敏度。
[0032] 本方法探测在液体试样中被分析物。该方法包括步骤：(a)获得一探针，其具有被 固定在该探针梢端上的第一抗体，其中该梢端表面的直径< 5毫米；(b)将该探针梢端浸入 包含具有被分析物的样品溶液的样品容器中，将被分析物与在探针梢端的第一抗体结合； (C)将该探针梢端浸入包含试剂溶液的试剂容器，该试剂溶液包括和一结合配对的第一成 员结合的第二抗体分子试剂以结合该试剂和被分析物；（d)将该探针梢端浸入含洗液的洗 涤容器中来洗涤探针梢端；（e)将该探针梢端浸入含有扩增溶液的扩增容器中，该扩增溶 液中含有一聚合物，该聚合物结合有至少5个分子的该结合配对的第二成员和至少25个荧 光标记，以在该探针梢端上形成该被分析物，该第一抗体，该第二抗体，和该结合配对的第 一和第二成员间的免疫复合体，其中该聚合物是支化的，并且其分子量至少为约一百万道