啶）/三丙基胺（TPA)衰变发射一个光子使钌（双吡啶）再生与另一个三丙基胺 (TPA)分子发生反应。最后三丙基胺（TPA)用完。如果钌（双吡啶）在表面密布，三丙基 胺（TPA)将在局部更快地被用完。由于在化学发光标记间的间隔，交联聚合物产生产生更 高效的化学发光。
[0056] 观测到Cy5标记的单个链酶亲和素的可忽略的循环扩增。带有四个结合位点的单 个链酶亲和素和标记有4-5个生物素的抗体被估计能够在探针表面形成交替层。然而，在 结合配对的一个成员已经结合的探针表面可能限制其层结构的旋转程度从而在空间上阻 碍了后续层的形成。Cy5_链酶亲和素阴性结果的第二个可能性是有层结构的形成但是Cy5 荧光被淬灭。Cy5,与许多荧光染料一样，能有自己的荧光淬灭，通常通过一个能量转移的机 理。能量转移淬灭的效率是由供体和受体染料间的距离决定的。交替层的形成能产生密集 叠加的Cy5_链酶亲和素其中Cy5分子非常接近并且因此可以产生荧光淬灭。
[0057] 循环扩增的另一重要方面是探针在相同的试剂容器，洗涤容器，和扩增容器中来 回转移，而无需使用新的含有新溶液的容器。在结合步骤中探针的小的表面面积能降低试 剂和扩增聚合物的消耗。这一特性大大简化了检验的试剂需求和整体消耗系统的设计。在 循环扩增中的每个结合步骤只是一个30秒到2分钟的短时段，例如，1分钟。因此，循环扩 增没有引起分析时间的延长。10-15分钟的高敏感分析是可行的。
[0058] 含多个结合分子和化学发光标记的高分子支化聚合物
[0059] 本发明还涉及组合物，其包括（a)分子量至少为500, 000或一百万道尔顿的支化 聚合物，（b)至少5个结合分子，和（c)至少25个化学发光分子，其中这些结合分子和化学 发光分子与该交联Ficoll相连。该组合物优选包括5-50或5-100个结合分子和25-100 或25-500个化学发光分子。
[0060] 该聚合物可能是一个聚糖（例如，聚蔗糖或葡聚糖），一个多核苷酸，一个树状聚 合物，一个多元醇，或是聚乙二醇。一般的聚糖对许多通常在免疫分析中应用的固相物质呈 现可忽略的非特异性结合。市场上的聚蔗糖有70K和400K道尔顿的分子量。交联聚蔗糖 (Ficoll)是优选聚合物。
[0061 ] 对本发明有用的化学发光标记具有< 5, 000的分子量，优选< 2, 000，例如 500-2000或100-2000道尔顿。优选的化学发光标记包括，但不限于，三（双吡啶）合钌 (II)，鲁米诺，叮啶酯，和氯化血红素。
[0062] 在一实施例中，化学发光分子被直接连接到聚合物上。在另一实施例中，化学发光 分子通过结合配对被间接连接到聚合物上。
[0063] 电化学发光检测装置
[0064] 本发明针对一个用于测量在探针梢端的化学发光信号的电化学发光探测系统。
[0065] 一个电化学发光系统包括：(a)长度比宽度的纵横比至少为5比1的探针，该探针 具有第一和第二端，该第二端具有和涂覆有抗体且和带有化学发光标记的免疫复合物结合 的传感表面，在此探针由一个传导材料制成并且充当工作电极来产生电化学反应；(b) - 个对应电极；（c)指向该传感表面的会聚透镜；和（d)用于检测该化学发光标记所发光的光 学探测器；其中该会聚透镜会聚该发射光并将其引导至该光学探测器。
[0066] 该探针可以由任何传导性物质制成，例如金属，金属氧化物和碳，例如，银，金，白 金，铜，二氧化钛，石墨，和其任何组合。该探针可以为任何形状，如杆形，圆柱形，圆形，方 形，三角形等，其长度比宽度的纵横比至少为5比1，优选为10比1。因为在免疫分析期间 该探针被浸在样品溶液和一种或多种分析溶液中，需要有纵横比至少为5比1的长探针，使 该探针的梢端能够浸入该溶液。该探针的传感表面被被分析物-结合分子所覆盖，例如抗 体，且结合了化学发光标记。
[0067] 在一优选实施例中，该探针具有用于结合分子的小梢端。该梢端具有较小的表面 面积，其直径< 5毫米，优选< 2毫米或< 1毫米，例如，0. 5-2mm。该探针梢端的小表面赋 予它若干优点。本发明利用一探针具有用于结合被分析物的小梢端。该梢端具有较小的表 面面积，其直径< 5毫米，优选< 2毫米或< 1毫米，例如，0. 5-2mm。该探针梢端的小表面 赋予它若干优点，例如，较低的非特异性结合，较少携带试剂，便于洗涤，和较少消耗试剂。
[0068] 所发光的光子可通过光电倍增管（PMT)，硅光电二级管，或黄金覆盖的光纤传感器 探测出。
[0069] 图2显不了本发明的一个实施例。杆的低端被当作一个传感表面。化学发光标记 结合到传感表面。为了探测发光，探针杆的传感端浸没到带有透明底部的容器，该透明底部 装有含共反应剂的测量溶液。该透明底部的材料可选自塑料，玻璃或石英。施加等变压到 工作电极和对应电极上，所发光通过会聚透镜校正并且指向光电倍增管（PMT)来测量。
[0070] 本发明的一个独特方面是探针充当工作电极，因为钌（II)/三丙基胺氧化还原反 应需要出现在电极表面或非常接近其表面，从而提供了高效放光的优点。该光学设备配置 能够对工作表面电极施用多个电压波形，通常在大约1伏特产生发光。
[0071] 通过以下实施例进一步示例本发明，所述实施例不应被解释为将本发明的范围限 定为其中描述的具体步骤。
【具体实施方式】
[0072] 实施例1 :带有固定化的第一抗体的探针的制备
[0073] 石英探针，直径1mm，长度2cm，按照制造商的规程利用化学气相沉积过程（Yield Engineering Systems，1124P)涂有氨丙基甲硅烷。然后将该探针梢端浸没在含有鼠类单克 隆抗荧光素（Biospacific)，10 μ g/ml PH7. 4的PBS (磷酸盐缓冲液）的溶液中。在抗体吸 附到探针20分钟后，探针梢端在PBS中冲洗。
[0074] 从HyTest获得的，用于肌钙蛋白I (Tnl)和脑钠肽（BNP)的捕捉抗体通过标准方 法用荧光素进行标记。通常，每个抗体有大约4个荧光素取代基。涂有抗荧光素的探针浸 没于用荧光素标记的捕捉抗体溶液（5 μ g/ml)中，5分钟后在PBS中冲洗。
[0075] 实施例2.交联聚蔗糖（Ficoll)400-SPDP的制备
[0076] 交联聚蔗糖（Ficoll) 400-SPDP (6-[3-[2-吡啶基二硫基]丙酰胺基]己酸琥珀酰 亚胺酯，Invitrogen)依照美国公开2001/0312105的实施例1来制备。图5显示了该制备 的流程图。
[0077] 实施例3. Cy5_链霉亲和素的制备
[0078] 将32微升Cy5_NHS (GE Healthcare)在DMF中的5毫克/毫升溶液和1毫升链 霉亲和素 （Scripps Labs)在0. 1M，pH为9. 5的碳酸钠缓冲液中的2. 4毫克/毫升溶液在 30°C反应40分钟。将该混合物施加于10柱（Pharmacia)，去除未结合的Cy5。光谱分 析显示每链霉亲和素分子连接2. 8个Cy5。
[0079] 实施例4. Cy5_链霉亲和素-交联Ficoll的制备
[0080] 将5. 8微升SMCC (4- (N-马来酰亚胺基甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯） (Pierce Chemical)在DMF中的10毫克/毫升溶液和在1毫升，pH为7. 4的PBS中的2毫 克Cy5-链霉亲和素在室温下反应1小时。将该混合物施加于10柱，去除未结合的SMCC。
[0081] 通过将30微升38晕克/毫升的DTT加入在1 _升PBS中的1 _克交联Ficoll 400-SPDP并在室温下反应1小时，来去保护交联Ficoll 400-SPDP上的硫醇，随后用HHO 柱纯化该交联Ficoll。
[0082] 将该Cy5_链霉亲和素-SMCC与交联Ficoll 400-SH混合，并在室温下反应过夜。 然后加入10微升12. 5晕克/毫升的NEM(Aldrich)，并在室温下反应1/2小时。然后在 Sepharose 4B CL柱上纯化该结合物。估计每个聚鹿糖（两百万道尔顿）结合大约20-30 个链酶亲和素，并且每个链酶亲和素结合2-3个Cy5。
[0083] 实施例5 :第一阅读，Cy5_链酶亲和素 vs. Cy5_链酶亲和素-交联Ficoll (非循 环）
[0084] 用一个BNP分析来对比Cy5_链酶亲和素和Cy5_链酶亲和素 -Cx Ficoll的荧光 信号。该分析利用BNP单克隆抗体的夹心对（Hytest)。一个用荧光素标记，第二个用生物 素标记。两个标记都通过每个抗体被4-5个半抗原取代的标准方法操作。如实施例1所述 将荧光素-抗体结合到探针。在分析中，将BNP校准器（Hytest)刺入正常的混和人血浆， 然后由含有5mg/ml BSA和0. 05 %吐温20的PBS (分析缓冲液）中稀释3倍。该探针梢端 浸没于BNP试样中并且在转速为750rpm的轨道运动（Imm直径行程）的试样孔中室温培养 5分钟。该探针保持固定。探针在PBS，0. 05%吐温20冲洗3次，每次10秒。在冲洗序列 后，探针浸没于在分析缓冲液中含有浓度为10 μ g/ml的生物素基化的抗BNP溶液中，随后 在转速500rpm下培养2分钟，然后洗涤3次。然后探针被转移到含有Cy5-链酶亲和素（实 施例2)或Cy5-链酶亲和素 -Cx Ficoll(实施例3)的溶液中。在以上两个实施例中的链 酶亲和素标记有大约2-3个Cy5并且浓度为10 μ g/ml。在转速500rpm培养1分钟后，该 探针进行一个冲洗序列。然后在探针远梢端的荧光通过如图1所示的光学设置测量。带有 Cy5-链酶亲和素和Cy5-链酶亲和素 -Cx Ficoll的分析设置如图4所示。其结果在表1中 所示。在第一次结合后的测量称为第一阅读（非循环）。
[0085] 表L第一阅读：Cy5-链酶