尔顿，发光标记的分子质量小于2000道尔顿；（f)将该探针梢端浸入含第二洗液的第二洗 涤容器以洗涤探针梢端；（g)重复步骤（c)至（f) 1-10次，且（h)通过测定在探针梢端的发 光信号来探测免疫复合物，其中该第一抗体和该第二抗体是针对该被分析物的抗体。
[0033] 在步骤（a)中，该探针可以为任何形状，如杆形，圆柱形，圆形，正方形，三角形等， 其长度比宽度的纵横比至少为5比1，优选为10比1。优选杆型。因为在免疫分析期间该 探针被浸在样品溶液和一种或多种分析溶液中，需要有纵横比至少为5比1的长探针，使该 探针的梢端能够浸入该溶液。对荧光检测，探针可以为整体式衬底。
[0034] 该探针具有用于结合被分析物的小梢端。该梢端具有较小的表面面积，其直径< 5 毫米，优选<2毫米或<1毫米，例如，0.5-2mm。该探针梢端的小表面赋予它若干优点。首 先，小表面面积具有更少的非特异性结合，并因此产生更低的背景信号。第二，由于该梢端 的表面面积小，携带在该探针梢端上的试剂或样品也极小。此特征使该探针梢端便于洗涤， 由于洗液具有较大的体积，其在该洗液中导致的污染可以忽略。进一步，该探针梢端的小表 面面积具有结合量小。因此，当该探针梢端被浸入试剂溶液中时，该试剂的结合不会耗损大 量该试剂。该试剂的浓度被有效地维持不变。对洗液污染可忽略不计以及试剂消耗少可以 使该试剂溶液，该扩增溶液，以及该洗液被重复使用许多次，例如1-10次。
[0035] 该探针的传感表面被涂覆有可以结合试样中的被分析物的第一抗体。将试剂固定 至该固相（该探针梢端的传感表面）的方法在免疫生物化学中是常见的，其涉及该固相和 试剂之间共价的，疏水性的或静电键的形成。第一抗体分子可以被直接固定在该传感表面 上。或者，第一抗体可以通过结合配对被间接固定在该传感表面上。例如，可以先通过对该 固体表面的吸附或通过和该固体表面上涂覆的氨基丙基硅烷的共价结合固定抗荧光素，然 后用荧光素标记的第一抗体可以通过荧光素和抗荧光素的结合（结合配对）结合至该固体 表面。
[0036] 在步骤（b)，该探针梢端被浸入到样品容器中20秒到60分钟，优选20秒到10分 钟，以结合被分析物到探针梢端的第一抗体。
[0037] 在步骤（b)之后，该探针可选地被冲洗1-5次，优选在含有洗液的洗涤容器中冲洗 1-3次。这额外洗涤步骤可能不需要，因为由于小的结合表面面积携带的溶液是最小限度 的。洗液通常含有缓冲液和表面活性剂，例如吐温20。
[0038] 在步骤（c)，该探针梢端被浸入到样品容器中20秒到10分钟，优选20秒到2分 钟，以结合试剂到探针梢端的被分析物。该试剂溶液包括一个与结合配对的第一成员结合 的第二抗体的试剂。
[0039] 该结合配对通常为半抗原和其抗体，配位体及其受体，核酸的互补链，或外源凝集 素和碳水化合物。例如，结合配对是，生物素和链霉亲和素，生物素和抗生物素蛋白，生物 素和亲和素（neutravidin)，荧光素和抗荧光素，异羟基洋地黄毒苷/抗异羟基洋地黄毒苷 (digioxigenin/anti-digioxigenin)，DNP (二硝基苯酸）和抗-DNP。优选，结合配对的第 一成员是生物素和结合配对的第二成员是链霉亲和素。
[0040] 在步骤（d)，该探针被冲洗1-5次，优选在含有洗液的洗涤容器中冲洗1-3次。洗 液通常含有缓冲液和表面活性剂，例如吐温20。
[0041] 在步骤（e)，该探针梢端被浸入到含有扩增溶液的扩增容器中20秒到5分钟，优 选20秒到2分钟，以在该探针梢端上形成该被分析物，该第一抗体，该第二抗体，和该结合 配对的第一和第二成员间的免疫复合体。该扩增溶液中含有一聚合物，该聚合物结合有至 少5个分子的该结合配对的第二成员和至少25个荧光标记。该聚合物是支化的，并且其分 子量至少为500, 000,优选一百万道尔顿。该聚合物可能是一个聚糖（例如，聚蔗糖或葡聚 糖），一个多核苷酸，一个树状聚合物，一个多元醇，或聚乙二醇。该聚合物优选具有2-或 3_维结构的支化物。该聚合物优选包括5-50或5-100个结合分子和25-100或25-500个 发光分子。
[0042] 对本发明有用的发光标记具有分子量小于5, 000,优选小于2, 000,例如500-2000 或100-2000道尔顿。在一实施例中，该发光标记是一个选自青色素，香豆素，夹氧杂蒽 和其衍生物的一个荧光染料。例如，该荧光染料是Cy5 (分子量792)，Alexa Fluor 647， DyLight 350(分子量 874) ,DyLight 405(分子量 793) ,DyLight 488(分子量 71011)， DyLight 550 (分子量 982) ,DyLight 594 (分子量 1078) ,DyLight 633 (分子量 1066)， DyLight 650 (分子量 1008)，DyLight 680 (分子量 950)，DyLight 755 (分子量 1092)， DyLight 800 (分子量1050) ,Oyster荧光染料，IR染料，或包括多个螯合有稀土金属（例如 镧系元素（铕，针，钐，或镝））的环的有机化合物。
[0043] 在另一实施例中，该发光标记是选自三（双吡啶）合钌（II)(分子量1057)，鲁米 诺（分子量177)，叮啶酯（9[[[4-3-[(2,5_二酮-1-吡咯烷基）氧]-3-酮基丙基]苯氧] 羰基]-10-甲基卩丫啶三氟甲磺酸，分子量632)，和氯化血红素（分子量652)的化学发光分 子。
[0044] 当该结合分子是多肽或蛋白质时，该荧光标记可以采用科学和专利文献中所述的 常规的结合化学作用通过多种部分与之共价结合，包括二硫化物，羟苯基，氨基，羧基，吲 哚，或其它官能团。
[0045] 该结合分子与多核苷酸的共价结合可以用常规的结合化学作用通过多种部分实 现，包括醛，酮，异硫氰酸酯，亚氨酸酯，肌苷，酰基和烷基，而许多参考文献也教导了用生物 素的衍生。（Leary 等（1983)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 :4045-4049 ;W086/02929 ;EP 063 879 ;Langer 等（1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 :6633-6637 ;和 EP 2009 996) 〇
[0046] 在每一步（b)，（c)，和（e)中，反应可以通过搅拌或混合在容器中的溶液来加速。 例如，可以引起该溶液横向流动（轨道流）经过该探针梢端，其加速固定化至固相的配偶体 对其靶分子捕获。例如，该反应容器可以被装在轨道振荡器上，并且该轨道振荡器以至少 50rpm的速度旋转，优选至少200rpm，更优选至少500rpm，如500-1，OOOrpm。可选地，该探 针梢端以〇. 01至10毫米/秒的速度垂直于该轨道流的平面上下移动，以在该探针梢端以 上和以下引起额外的溶液混合。
[0047] 在步骤（f)，该探针在含有洗液的洗涤容器中被冲洗1-5次，优选1-3次。洗液通 常含有缓冲液和表面活性剂，例如吐温20。
[0048] 步骤（g)是通过重复步骤（c)至（f) 1-10,优选1-5次或2-3次的循环扩增。每个 循环包括将探针放置回相同的试剂容器，相同的第一洗涤容器，相同的扩增容器，和相同的 第二洗涤容器。
[0049] 在步骤（h)，该免疫复合物可通过读取在探针梢端被探测的发光信号探测出。对于 荧光标记，正如在美国出版物2011/0312105(图1)中所描述的，探针被放置在一个有透明 底的孔中并且通过检测仪读取。
[0050] 对于化学发光标记，探针被放置于一个含有共反应剂的测量溶剂的有透明底的 孔。例如，如果化学发光标记是三（双吡啶）合钌（II)，其共反应剂是三丙基胺。如果化学 发光法标记是鲁米诺，共反应剂是过氧化氢和氢氧化物盐的水溶液。所发的光可通过光电 倍增管（PMT)测量。
[0051] 对于电化学发光（ECL)，ECL分析仪的原理和主要元件在Blackburn等（Clin. Chern. 37:1534-1539(1991))中有所描述，在此作为参考并入本文。在探针被放置到含有 共反应剂的测量溶剂的有透明底的孔后，施加电压到工作电极和对应电极，所发的光通过 光电倍增管（PMT)测量。
[0052] 在一优选实施例中，由抗体覆盖的探针充当ECL分析仪的工作电极（图2)。由于 钌（II)/三丙基胺氧化还原反应需要在电极表面或非常接近其表面时发生，这一方法提供 了高效放光的优点。
[0053] 图3显示了一个用于检测抗原被分析物的免疫分析形式的实施例。图4显示了在 循环扩增中的探针转移。
[0054] 在发光聚合物中有若干关键特性使其能实现循环扩增。聚合物本身应该是有低的 非特异性结合，应该是大于400或500KD分子量以提供一个多个结合分子（如链酶亲和素） 的高效载体。携带多个结合分子的能力对加强生物素结合能力和形成交替层是重要的，例 如生物素基化的抗体和链酶亲和素聚合物。聚合物应该是支化的或交联的，并且有二或三 维结构以进一步促进复合层结构的形成。标记的大小也是一个重要参数。当一个高分子量 标记结合到链酶亲和素时有可能改变其生物素结合能力和在循环扩增中的复合层结构形 成中产生位阻。标记应该是小的，其分子量< 5000道尔顿；优选< 2000道尔顿。
[0055] 当聚合物偶联结合到在免疫复合物中的第一层生物素-抗体时，它有充足残留的 生物素结合力来形成另一层生物素-抗体。聚合物的大小和它的支化结构在探针梢端产生 一个延展开的三维结构络合物，它减小在生物素-抗体和聚合物偶联以形成附加层时的空 间位阻。聚合物的分子量大到使标记了的链酶亲和素分子分开。在荧光分析中，间隔降低 了能量转移介导的荧光淬灭。在电化学分析中，由于聚合物的间隔和结构其具有相同的优 点。结合到固相免疫复合物中的舒（双吡啶）标记与流动相的三丙基胺（TPA)发生反应。 钌（双吡