专利名称：蛇床子素在制备抑制血管新生药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中草药单体蛇床子素的新用途，具体涉及蛇床子素在制备抑 制血管新生药物中的应用。
背景技术：
血管新生(angiogenesis)是在原有血管结构基础上产生新血管的过程，是 细胞与细胞、细胞与基质及细胞与细胞因子之间相互作用的结果。血管新生存在 于正常的生理过程中，例如胚胎发育过程和女性生理周期中。同时，血管新生还 存在于许多病理过程中。
血管新生是一个复杂的过程，包括五个基本过程①血管细胞分泌蛋白水 解酶降解血管基底膜；②内皮细胞穿过基底膜迁移到血管周围基质；③内皮细胞 增殖、相互黏附并连接；④形成管腔样结构；⑤基质重塑和平滑肌细胞的包绕及 血管的相互吻合形成血管网。
上世纪70年代，哈佛大学医学院福克曼(Folkman)提出肿瘤的生长与转移依 赖于血管新生，肿瘤在没有养分的供应下，只能长到2-3立方毫米。 一旦有新生 血管与其相连，肿瘤获得营养，以几何级数迅速生长，同时肿瘤细胞还可以通过 新生血管转移到其他器官，引起肿瘤转移，导致人体死亡，因此，可以通过抑制 血管新生抑制肿瘤。美国食品与药品管理局(FDA)已经批准某些血管新生抑制 剂用于肿瘤临床治疗，通过抑制血管新生来抑制肿瘤以及其他相关疾病具有广阔 的应用前景。
抗血管生成治疗与传统的抗肿瘤治疗相比，有以下优点l)血管内皮细胞 基因稳定，因此一般难以产生耐药性；2)抗瘤谱广，不良反应小；3)与传统的 化疗、放疗等联用，表现出较好的协同效应。目前，血管新生抑制剂或多种类似 制剂已用于治疗癌症和在进行临床试验。在诸多制剂中， 一些中草药单体被发现具有抗血管新生的作用。
已公开的研究表明蛇床子素具有抗肿瘤、抗骨质疏松、抗肝炎、抗变态反 应、抑制血小板聚集以及抗病毒等多种药理活性。但是，迄今为止，还没有关于 蛇床子素可以抑制血管新生或通过血管新生来抑制肿瘤的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供蛇床子素在制备抑制血管新生药物中的 应用。本发明的蛇床子素，是从伞形科植物中提取分离的纯天然香豆素类化合物， 英文名称为osthde或osthol，又名甲氧基欧芹酚或欧芹酚甲醚，其化学名称为 7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素，其分子式为C15H1603，分子量为244.29，其结构 式如下
本发明公开了蛇床子素的新用途以及其在制备血管新生药物中的应用。实验 表明，蛇床子素在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖实验、迁移实验(本专 利指Boyden小室迁移实验)、细胞成管实验、鸡胚尿囊膜血管新生等方面均有 明显的抑制作用，可用于制备抑制血管新生的药物。
本发明提供的技术方案是蛇床子素在制备抑制血管新生药物中的应用，尤其 是蛇床子素在抑制糖尿病综合症、乳腺癌、前列腺癌、类风湿性关节炎、血管瘤、 银屑病等血管新生性疾病方面的应用。所述抑制血管新生药物可以抑制肿瘤血管 新生，关节炎病变组织血管新生，新生血管性眼病，血管瘤病变组织血管新生， 银屑病病变组织血管新生，实体瘤病变组织血管新生，血管瘤，Kaposi' s肉瘤 (艾滋病患者最常见的恶性肿瘤)病变组织血管新生，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤 血液癌症、Paget' s疾病(慢性骨瘤样变性)血管新生。其中，所述关节炎为 类风湿性关节炎，炎性关节炎。所述眼病为新生血管性角膜疾病，新生血管性视 网膜疾病，血管新生性虹膜疾病，新生血管性青光眼，新生血管性脉络膜疾病，新生血管性结膜眼病，生成血管型白内障，新生血管性玻璃体眼病，新生血管性 视神经疾病。所述视网膜病为糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉闭塞，早产儿视 网膜病变，视网膜动脉闭塞。所述脉络膜病为湿性老年黄斑病变。所述实体瘤包 括原发性或继发性实体瘤。所述血管瘤包括多发性血管瘤，血管母细胞瘤，良性 血管增生疾病。
本发明提供的技术方案还包括含有有效量的式(I)蛇床子素以及药学可接受 成分的组合物在制备抑制血管新生药物中的应用。
根据本发明可以将治疗有效的蛇床子素(纯度298%)和药学上允许的任意 一种辅料制成药物组合物，也可以添加其他与蛇床子素没有拮抗作用的其他抗血 管新生药物。其制剂可以是药学上的任意一种剂型，包括但不限于末剂、散剂、、 片剂、丸齐!J、滴齐U、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、胶囊剂、糖衣剂、口服液、注射 剂、脂质体、舌下含片等。
为实施本发明的方法，蛇床子素可通过口服、肠胃外、吸入式喷雾或通过植 入式贮存器给药。"肠胃外"包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉 内、滑膜腔内、胸骨内、鞘内、病灶内及颅内注射或输入技术。口服可用固体或 液体状的剂量单位，如末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浮剂、 溶液剂、糖浆剂、滴剂、舌下含片等剂型进行给药。末剂是将本发明化合物磨成 适当的细度而制成。散剂是将本发明化合物磨成适当的细度，然后与同样细度的 医药用载体(如载体、甘露糖醇之类可食性碳水化合物等)混合制成。根据需要， 也可混入矫味剂、防腐剂、分散剂、着色剂、香料等物质。胶囊剂是将如上所述 制成粉末状的末剂和散剂或入片剂部分所述的颗粒化的物质填充到如明胶胶囊 外壳中而制成。也可将润滑剂和助流剂等混合到粉末状物质中，然后在胶囊中进 行填充操作。若添加助溶剂和崩解剂等，如聚乙二醇，碳酸钠，可改善胶囊摄取 时的药效。
图l:蛇床子素抑制人脐静脉内皮细胞增殖；
图2a，图2b:蛇床子素抑制人脐静脉内皮细胞迁移；图3a,图3b:蛇床子素抑制人脐静脉内皮细胞体外Boyden小室迁移；图4a，图4b:蛇床子素抑制人脐静脉内皮细胞体外成管；图5a，图5b:蛇床子素抑制鸡胚尿囊膜新生血管的形成。以上各图中，均以p〈0.05表示有显著差异，其中，*， p<0.05; **， p<0.01;承氺氺，p<0.001 。
具体实施例方式
实验例l:蛇床子素抑制人脐静脉内皮细胞体外增殖实验
目的和原理内皮细胞增殖实验采用MTS assay。 MTS assay是一种运用比色法间接测量活细胞数量的测定方法。在活细胞中，线粒体中的NADPH脱氢酶将MTS四唑盐化合物转变成一种溶于细胞培养液的有色物质-甲瓒，其颜色深浅与细胞株的活细胞数目在一定范围内高度相关。通过该方法可评价药物对细胞增殖能力的影响。
方法将人脐静脉内皮细胞接入96孔板中(5000个/ L)，分别加入含有不同浓度蛇床子素的培养基作用48—72小时，然后加入显色剂，孵育1—4小时。用酶标仪在490nm处读出每个孔的光吸收值。
结果与评价与对照组相比，加入蛇床子素的实验组，内皮细胞的增殖能力受到抑制，说明蛇床子素可以抑制内皮细胞的增殖，结果见图l。
实施例2:蛇床子素抑制人脐静脉内皮细胞体外迁移实验
目的和原理细胞迁移实验又称体外划痕实验。本实验通过在培养板中长满
的单层内皮细胞上制造划痕，在显微镜下观察，同时记下划痕处新迁入的内皮细胞的数量，来评价药物对内皮细胞迁移能力的影响。
方法将细胞接种于6孔板中，待细胞长至90%左右，用移液器吸头在每个孔中划十字划痕。用PBS将划下的细胞洗去，加入含不同浓度的药物以及VEGF的培养基，于37。C， 5%C02培养箱中培养至VEGF组长满
结果与评价实验结果如图2a，图2b所示，在显微镜下观察拍照统计。其中2a为对照组；2b为含蛇床子素100微摩尔/升组。与对照组相比，加入蛇床子素后，人脐静脉内皮细胞的迁移受到抑制，说明蛇床子素可以抑制人脐静脉内皮细胞的迁移。
实施例3:蛇床子素抑制人脐静脉内皮细胞体外Boyden小室迁移实验目的和原理人脐静脉内皮细胞体外Boyden小室迁移实验采Millipore公司的Boyden培养小室，在生长因子的诱导下细胞可以穿过小室8微米的膜，此实验可以检测药物对内皮细胞穿膜能力的影响。
方法将小室置入24孔细胞培养板中，加入明胶孵育30分钟，30分钟后弃去明胶，用PBS洗三遍。小室外加入含有VEGF的内皮细胞培养基，小室中接入一定数目的细胞，之后再加入不同浓度的蛇床子素药物，在37'C， 5%0)2培养箱中孵育四小时。
结果与评价四小时后，将小室内外的细胞培养液吸去，用棉棒将上层未迁移的细胞拭去，将小室浸泡在4%多聚甲醛中固定20分钟，用PBS洗三遍吸干，苏木精染色，用PBS将背景多余染料洗去，室温晾干，显微镜下拍照计数。结果如图3a，图3b所示其中3a为对照组；3b为含蛇床子素100微摩尔/升组。与对照组比，给予蛇床子素后，人脐静脉内皮细胞穿过小室的能力受到抑制，说明蛇床子素可以抑制内皮细胞穿过微孔膜的能力。
实施例4:蛇床子素抑制人微血管内皮细胞体外成管实验
目的和原理Matrigel是从小鼠肉瘤EHS (Engkebreth-Holm-Swarm)中抽提得到的可容性基底膜抽提物，富含细胞外基质蛋白，其主要成份是层粘连蛋白、胶原IV、硫酸肝素糖蛋白、TGF-e等。人脐静脉内皮细胞和人微管内皮细胞可以在Matrigel上贴附成管，可以利用人微血管内皮细胞在Matrigel上的这种成管特性来研究药物对内皮细胞成管的影响。
方法将Matrigel铺到24孔板上，于37"C， 5%0)2培养箱中放置30min待其多聚化。每孔加入一定量的细胞数目，再加入含有不同浓度蛇床子素的培养基，混匀。于37"C， 5X培养箱中培养16-18h在显微镜下观察微管形成情况。每孔选择上下左右四个不同部位，计算微管形成数量进行统计学分析。
结果与评价人微血管内皮细胞在Matrigel中生长16-18h后，单个细胞巻
7成管装并相互连接，形成三维网状结构。实验结果如图4a，图4b所示，其中4a为对照组；4b为含蛇床子素100微摩尔/升组。与对照组相比，给予蛇床子素之后，内皮细胞成管过程受到影响，三维网络结构受到破坏，说明蛇床子素可以抑制内皮细胞微管的形成。
实施例5:蛇床子素抑制鸡胚尿囊膜血管新生实验
目的和原理鸡胚尿囊膜模型目前来说，是一种较为理想的国内外筛选血
管新生类药物公认的筛选模型。将含药物的载体置于受精鸡胚尿囊膜表面的无血管区，可观察到药物对新的微血管生成的影响。
方法将受精的鸡胚置于孵化箱中孵化5天，在超净工作台中，用70%酒
精浸泡的棉球擦拭其表面，在鸡胚卵壳钝端(气室端)用镊子小心地开一个直径
约0.5厘米的小口，通过开出的小孔观察胚胎所在的位置，沿着相反的方向剥除
外壳，在血管稀疏的地方用镊子撕开气室膜露出尿囊膜。将不同量的蛇床子素分
别加到直径大小为0.5平方毫米的经过高压灭菌的滤纸片(德国Whatman公司)上，再将滤纸片加在尿囊膜上无血管区，用灭菌的透明胶带封口，放入孵育箱中继续孵育。
结果与评价放入滤纸片的鸡胚放入孵育箱中继续孵育两天后，揭去透明胶
带，在显微镜下拍照，计算滤纸周围2.5毫米环形范围内新生微血管的数量。实验结果如图5a，图5b所示，5a为对照组，不加蛇床子素；5b为含蛇床子素10微克/片组。与对照组比较，加蛇床子素之后，新的微血管生成受到抑制，说明蛇床子素可以抑制鸡胚尿囊膜新血管的生成。
权利要求
1.蛇床子素在制备抑制血管新生药物中的应用，其中，所述蛇床子素的化学结构式如下
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制血管新生药物可抑制 肿瘤血管新生。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制血管新生药物可抑制 病变组织血管新生。
4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤血管新生包括白血病、 淋巴瘤、骨髓瘤血液癌症的血管新生，Kaposi' s肉瘤病变组织血管新生， Paget' s疾病血管新生，血管瘤，血管瘤病变组织血管新生，实体瘤病变组 织血管新生，多发性血管瘤，血管母细胞瘤，良性血管增生疾病。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病变组织血管新生包括关 节炎病变组织血管新生，新生血管性眼病，银屑病病变组织血管新生。
6. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，含有有效量的式(I)蛇床子素 以及药学可接受成分的组合物在制备抑制血管新生药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种蛇床子素在制备抑制血管新生药物中的应用。所述蛇床子素可以抑制肿瘤血管新生，关节炎病变组织血管新生，新生血管性眼病，血管瘤病变组织血管新生，银屑病病变组织血管新生，实体瘤病变组织血管新生，血管瘤，Kaposi’s肉瘤病变组织血管新生，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤血液癌症，Paget’s疾病血管新生。还提供了含有有效量的蛇床子素以及药学可接受成分的组合物在制备抑制血管新生药物中的应用。
文档编号A61K31/37GK101647796SQ20091005624
公开日2010年2月17日 申请日期2009年8月11日 优先权日2009年8月11日
发明者代付军, 刘明耀, 卢彬彬, 宋雅娟, 京 张, 张晓丽, 易正芳, 力 赖 申请人:华东师范大学