专利名称：漆树酸在制备抗血管新生药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的抗血管新生中草药单体漆树酸以及该化合物在治疗和 预防血管新生相关疾病等领域的应用。
背景技术：
血管新生是指先前已经存在于组织的成熟血管内皮细胞通过增殖和游走以 发芽或者嵌入的方式形成新的子代血管的过程。血管新生在癌症、类风湿性关节 炎、糖尿病性视网膜病变、老年性黄斑病变、白血病、动脉粥样硬化、子宫内膜 炎、牛皮癣、子宫平滑肌瘤、良性前列腺肥大等几十种疾病及炎症反应和伤口愈 合中都起到关键作用。而癌症是人类的一大杀手，肿瘤细胞种类繁多，极易发生突变，且易产生抗 药性，传统的化疗放疗对正常细胞损伤极大，研究发现，在没有营养成分和氧气 的供应下，肿瘤只能长到2-3立方毫米， 一旦有新生血管与其相连，肿瘤就会以 几何级数迅速生长，肿瘤血管同时也为肿瘤细胞提供转移的通路，因此，肿瘤生 长与转移都依赖于血管新生。较之传统的治疗方式，抗血管新生疗法靶定于肿瘤 灶的微血管内皮细胞而不是肿瘤本身，血管内皮细胞遗传稳定，突变概率小，不 易产生抗药性，且具有广谱的抗肿瘤活性，所以抗血管新生药物的不断发展已然 成为治疗癌症和其他血管新生依赖性疾病的诱人的治疗方法，目前FDA已批准上 市了多种抗血管新生药物来治疗肿瘤。漆树酸又称檟如酸，来源于银杏叶和腰果，漆树酸为银杏的主要抗菌成分， 对多种革兰氏阴性菌及阳性菌均有抑制作用，漆树酸能抑制组蛋白乙酰转移酶的 活性，但自身活性受脂肪氧化酶的抑制，在鼠肝线粒体氧化磷酸化时解偶联，中 医上，漆树酸具有抗菌、扩张、收敛改善微循环、促进人体新陈代谢、增强人体 生机、补肾健脑的作用。目前国内外没有漆树酸对血管新生作用方面的报道。发明内容本发明要解决的技术问题在于提供一种中草药单体漆树酸在制备抗血管新 生药物方面的应用。漆树酸，Anarcardic Acid， C22H3603，分子量348. 5，其结构式如式(1)所示OH O式(1)本发明要解决的技术问题在于漆树酸在制备抗血管新生药物中的应用，尤 其是漆树酸在抑制癌症以及类风湿性关节炎、牛皮癣、糖尿病综合症、动脉粥样 硬化、血管瘤等血管新生依赖性疾病中的相关应用。亦可以抑制肿瘤血管新生， 关节炎病变组织血管新生，新生血管性眼病，血管瘤病变组织血管新生，银屑病病变组织血管新生，实体瘤病变组织血管新生，血管瘤，Kaposi， s肉瘤病变组 织血管新生，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤血液癌症，Paget' s疾病血管新生。本发明要解决的技术问题可以制备抑制血管新生药物以治疗类风湿性关节 炎，炎性关节炎；新生血管性角膜疾病，新生血管性视网膜疾病，新生血管性虹 膜疾病，新生血管性青光眼，新生血管性脉络膜疾病，新生血管性结膜眼病，新 生血管性白内障，新生血管性玻璃体眼病，新生血管性视神经疾病；糖尿病性视 网膜病变、视网膜静脉闭塞，早产儿视网膜病变，视网膜动脉闭塞；湿性老年黄 斑病变；原发性或继发性实体瘤；多发性血管瘤，血管母细胞瘤，良性血管增生 疾病。本发明要解决的技术问题在于提供含有有效量的式(I)漆树酸以及药学可 接受成分的组合物在制备抑制血管新生药物中的应用。根据本发明可以将治疗有效量的漆树酸和药学上允许的任意一种辅料制成 药物组合物，也可以添加其他与漆树酸没有拮抗作用的抗血管新生药物。其制剂 可以是药学上的任意一种剂型，包括但不限于片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、口 服液、注射剂、脂质体等。为实施本发明的方法，漆树酸可通过口服、肠胃外、吸入式喷雾或通过植入 式贮存器给药。"肠胃外"包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜腔内、胸骨内、鞘内、病灶内及颅内注射或输入技术。 口服可用固体或液体状的剂量单位，如末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、滴剂、舌下含片等剂型进行给药。末剂是将本发明化合物磨成适当的细度而制成。散剂是将本发明化合物磨成适当的细度，然后与同样细度的医药用载体(如载体、甘露糖醇之类可食性碳水化合物等)混合制成。根据需要，也可混入矫味剂、防腐剂、分散剂、着色剂、香料等物质。胶囊剂是将如上所述制成粉末状的末剂和散剂或入片剂部分所述的颗粒化 的物质填充到如明胶胶囊外壳中而制成。也可将润滑剂和助流剂等混合到粉末状 物质中，然后在胶囊中进行填充操作。若添加助溶剂和崩解剂等，如聚乙二醇， 碳酸钠，可改善胶囊摄取时的药效。本发明公开了中草药单体漆树酸在制备抗血管新生药物中的应用。实验表 明，漆树酸在人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)增殖实验、人脐带静脉内皮细胞迁 移实验、人脐带静脉内皮细胞Boyden小室迁移实验、人脐带静脉内皮细胞成管 实验、鸡胚尿囊膜血管新生、小鼠角膜试验和小鼠荷瘤试验上均有明显的抑制作 用，可用于制备抑制血管新生的药物。
图1为漆树酸抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖；图1中，以p<0.05表示有显著差异；其中，*表示pO.05; **表示P<0.01;***表示p<0.001 。图2为漆树酸抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移；图3为漆树酸抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC) Boyden小室的迁移；图4为漆树酸抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)成管；图5为漆树酸抑制鸡胚尿囊膜新生血管形成；图6为漆树酸抑制小鼠角膜新生血管形成；图7为漆树酸抑制裸鼠肿瘤生长；图8为漆树酸抑制裸鼠肿瘤微血管形成。3实施例1:漆树酸抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖目的和原理内皮细胞增殖实验采用MTS assay。 MTS assay是一种运用比色法间接测 量活细胞数量的测定方法。CellTiter 96 Aqueous单溶液试剂包含一种四唑化 合物(内盐；MTS)和一个电子耦合试剂(乙硫吩嗪；PES)。 MTS可被有代谢 活性细胞中脱氢酶作用生成可溶于组织培养基的颗粒，在490nm测量产物的吸 光值与培养物中活细胞的数量成正比。方法96孔板中加入人脐静脉内皮细胞，设置对照组和加样组，对照组加 入溶剂，加样组加入含有不同浓度的漆树酸，孵育48 72小时后，加入细胞增 殖检测试剂，孵育3小时，用酶标仪在490nm处检测光吸收值。结果与评价如图1所示，与对照组相比，人脐静脉内皮细胞的增殖能力受 到抑制，说明漆树酸可以抑制内皮细胞的增殖。实施例2:漆树酸抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移目的和原理在血管内皮细胞生长因子(VEGF)的作用下，人脐静脉内皮 细胞可以向没有细胞的划痕区域迁移。通过观察迁入划痕区的内皮细胞量，来评 价漆树酸是否具有抑制人微血管内皮细胞迁移的能力。方法在6孔板中加入人微血管内皮细胞，大约长满时，用tip头划一个十 字形划痕，用PBS洗净划下的细胞，加入VEGF化5以及含有不同药物浓度的培 养基，培养至VEGF组长满。结果与评价如图2所示，在显微镜下观察并拍照，结果显示与对照组相比， 人脐静脉内皮细胞的迁移受到抑制，说明漆树酸可以抑制人微血管内皮细胞的迁 移。实施例3:漆树酸抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC) Boyden小室迁移 目的和原理Boyden小室，用于研究白细胞的趋化性，这种研究基于小室 被微孔分离成两个部分。细胞置于上面的部分，下面的部分含有趋化因子，在趋化因子的诱导下，上层细胞可以穿过微膜孔迁移至膜的底部并贴附在膜的背面。 细胞在生长因子的诱导下可以透过多聚碳酸盐滤膜，此实验可以检测药物对内皮 细胞有阻力迁移能力的影响。方法用明胶将小室包被，孵育后弃明胶，用PBS洗三遍。小室外24孔板中加入含有血清和VEGF的内皮细胞培养基。小室中接入细胞，加入等量不 同浓度的药物，在培养箱中孵育四小时后，弃培养基，用多聚甲醛固定，用PBS 洗三遍，苏木精染色，用PBS洗，晾干，显微镜下观察拍照。结果与评价如图3所示，与对照组比，人脐静脉内皮细胞穿过Boyden小 室的能力受到抑制，说明漆树酸可以抑制内皮细胞有阻力的迁移的能力。实施例4:漆树酸抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)成管目的和原理Matrigel是从小鼠肉瘤中抽提得到的可溶性的基底膜抽提物。富含细胞外基质蛋白，人脐静脉内皮细胞可以在Matrigel上贴附成管，可以利用人脐静脉内皮细胞在Matrigel上的这种成管特性来研究药物对血管形成的影响。 方法将Matrigel铺到24孔板上，孵育待其凝固。每孔加入人脐静脉内皮细胞，再加入不同浓度漆树酸的培养基。在培养箱中孵育后在显微镜下观察微管形成情况并拍照。结果与评价如图4所示，人脐静脉内皮细胞在Matrigel中生长，单个细 胞在Matrigel中延伸，形成三维网状结构。与对照组相比，内皮成管过程受到影 响，三维网络结构受到破坏，说明漆树酸可以抑制人脐静脉内皮细胞微管形成。实施例5:漆树酸抑制鸡胚尿囊膜新生血管形成目的和原理鸡胚尿囊膜模型目前是较为理想的国内外筛选血管新生类药物 公认的筛选模型。将含药物的载体置于受精鸡胚尿囊膜表面的无血管区，可观察 到药物对新的微血管生成的影响。方法蛋壳表面消毒后置于培养箱中孵化5天，在超净工作台中，在蛋壳钝端(气室端)开口，在血管稀疏的地方撕开气室膜露出尿囊膜，加入含不同浓度漆树酸的圆形滤纸片(直径5毫米)，用灭菌的透明胶带封口，继续孵育，两天 后剥壳暴露尿囊膜，显微镜下观察拍照。结果与评价如图5所示，与对照组比较，新的微血管生成受到抑制，说明 漆树酸可以抑制鸡胚尿囊膜新血管的生成。
实施例6:漆树酸抑制小鼠角膜新生血管形成
目的与原理小鼠角膜是一个无血管区域，在小鼠角膜上做一个小袋，植入 含有血管内皮细胞生长因子(VEGF)的缓释颗粒，可以诱导存在于角巩缘处的 血管向缓释颗粒的小袋生长，在缓释颗粒上同时加入漆树酸，观察这些诱导的血 管面积是否有改变。
方法将C57/BL6小鼠麻醉，固定，在角膜上开口，植入缓释颗粒，空白 对照组只含溶剂，VEGF对照组含血管内皮细胞生长因子(VEGF)和溶剂，试 验组含血管内皮细胞生长因子(VEGF)和漆树酸，试验后复苏，继续饲养一周， 显微镜下观察拍照。
结果与评价如图6所示，与对照组相比，新生血管明显受到抑制，说明漆 树酸可以抑制由血管内皮细胞生长因子(VEGF)诱导的新生血管形成。
实施例7:漆树酸抑制裸鼠肿瘤生长
目的与原理在裸鼠皮下注射肿瘤细胞，这些肿瘤细胞吸收小鼠体内养分，
迅速增殖形成肿瘤，加药处理，可以观察药物对肿瘤的作用效果。
方法在裸鼠背部皮下注射前列腺癌PC-3细胞，癌细胞增殖形成肿瘤，等
肿瘤到一定体积后，随机分为对照组和实验组，进行不同处理，对照组每天注射 药物溶剂，实验组每天注射药物，每天测量肿瘤体积，注射约一个月后进行肿瘤 剥离，拍照。
结果与评价如图7所示，与对照组相比，肿瘤生长明显受到抑制，说明漆 树酸可以抑制裸鼠肿瘤生长。
实施例8:漆树酸抑制裸鼠肿瘤微血管形成
目的与原理血管假性血友病因子VWF作为血管内皮细胞标记物，可以用 来检测组织中的微血管分布情况。
方法实施例7剥离后的肿瘤进行固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，用血管假性血友病因子(vWF， vra相关抗原)染色，显色后拍照，深色部分为血 管内皮细胞。
结果与评价如图8所示，与对照组相比，裸鼠肿瘤微血管明显减少，说明 漆树酸可以抑制裸鼠肿瘤微血管形成。
权利要求
1.式(I)的漆树酸在制备抑制血管新生药物中的应用。结构式(I)
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制血管新生药物可抑制 肿瘤血管新生。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制血管新生药物可抑制 病变组织血管新生。
4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤血管新生包括白血病、 淋巴瘤、骨髓瘤血液癌症的血管新生，Kaposi' s肉瘤病变组织血管新生， Paget' s疾病血管新生，血管瘤，血管瘤病变组织血管新生，实体瘤病变组 织血管新生，多发性血管瘤，血管母细胞瘤，良性血管增生疾病。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病变组织血管新生包括关 节炎病变组织血管新生，新生血管性眼病，银屑病病变组织血管新生。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述新生血管性眼病包括新生 血管性角膜疾病。
7. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，含有有效量的式(I)漆树酸以及 药学可接受成分的组合物在制备抑制血管新生药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种漆树酸在制备抑制血管新生药物中的应用。本发明还提供所述漆树酸制备的抑制血管新生药物可以抑制肿瘤血管新生，关节炎病变组织血管新生，新生血管性眼病，血管瘤病变组织血管新生，银屑病病变组织血管新生，实体瘤病变组织血管新生，血管瘤，Kaposi’s肉瘤病变组织血管新生，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤血液癌症，Paget’s疾病血管新生。本发明还提供含有有效量漆树酸以及药学可接受成分的组合物在制备抑制血管新生药物中的应用。
文档编号A61K31/192GK101647793SQ20091005624
公开日2010年2月17日 申请日期2009年8月11日 优先权日2009年8月11日
发明者刘明耀, 卢彬彬, 吴媛媛, 京 张, 张晓丽, 易正芳, 贺利军, 力 赖 申请人:华东师范大学