一种检测3D类器官中P-gp介导的Rh123转运的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种检测3D类器官中p-gp介导的Rhl23 转运的方法及其在筛选P-gp抑制剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 目前在临床上，口服给药是最常见的给药方式，而且相对于静脉等其他的给药方 式，具有相对安全和方便的优点。药物进入机体内，一般要经过吸收、分布、代谢和排泄 的过程，对于口服药物来说，其在小肠的吸收最为重要，因为这是药物在机体内发挥药效 的前提。有研究表明，在新药研发过程中，大约40%的先导化合物在临床阶段被否决的 最常见原因包括了药动学性质不理想，尤其是口服后吸收性较差，造成药物的生物利用 度太低。因此，在化合物筛选的早期阶段，不仅要关注化合物的活性，也要对其药动学性 质进行合理的评估，以期减少后期研究的投入和降低失败的风险。其中，基于P-糖蛋白 (P-glycoprotein,P-gp)转运体介导的药物筛选及药物吸收与外排的研究在新药研发中占 有重要的地位。
[0003]P-gp是腺苷三磷酸（ATP)依赖性药物外排转运体，属于ATP结合盒（ATPbinding cassette,ABC)转运体家族中最大的一个亚型，亦是最重要的亚型之一。1976年，Juliano 等人首次在秋水仙碱耐药的中国仓鼠卵巢细胞中发现了高分子质量（170kD)的细胞膜糖 蛋白，并因其表达水平与细胞膜的通透性、细胞内的药物浓度以及细胞耐药程度有关而将 其命名为P-gp。研究发现，P-gp在小肠粘膜的上皮细胞等正常的组织和细胞中也有表 达。机体出于对自身的保护，药物等外来的有害物质在小肠的吸收就会受到限制，这也是 造成口服药物在体内生物利用度降低的原因之一，进而影响了药效的发挥。因此，P-gp 在药代动力学，特别是在药物的吸收与外排的过程中发挥着重要的作用。另外，P-gp在 肿瘤细胞中的过度表达限制了抗肿瘤药物的摄取，是造成肿瘤细胞多药耐药（Multidrug resistance,MDR)现象产生的重要原因。
[0004] 随着技术的发展及科研的需要，多种利用体外模型来模拟人的小肠上皮，并进行 P-gp介导的药物转运的研究相继被报道。其中，基于人的结肠癌细胞系（caco-2)建立的细 胞单层转运模型是国内外应用最广泛的模型。在转运小室（Transwell)的碳酸聚酯膜上培 养caco-2细胞，通过细胞之间的紧密连接形成具有极性的细胞单层，可用于研究P-gp底物 的吸收与外排。虽然该模型被视为体外研究药物转运的标准，但是，其存在的一些局限性依 然不能被忽视。例如，caco-2肿瘤细胞在生理和形态上与正常的小肠上皮细胞有很大的差 另IJ;而且，细胞的培养条件和代数会对模型的稳定性造成影响；另外，培养周期（21天）过 长也是高通量筛选的一个制约因素。因此，非常有必要建立一种全新的体外研究P-gp介导 的药物转运的模型。
[0005] 2009年，Toshiro Sato等人报道了在体外利用单个小肠隐窝可以分化形成绒毛 状的上皮结构。小肠隐窝中存在的干细胞在适宜的条件下具有分化再生功能，在基质胶中 可以形成一个三维的球状类器官（organoid)结构，因此称之为3D类器官。3D类器官中新 形成的隐窝向外侧突起，内侧形成了绒毛状的结构，相比于caco-2细胞转运模型，3D类器 官是由正常的小肠干细胞分化而来，因此其在生理上与小肠上皮更为相似。而且，P-gp在 3D类器官中的表达的位置与表达量与其在小肠中的表达没有明显差异。另外，培养周期短 (3-5天）也为P-gp介导的药物转运的筛选节约了时间和经济成本。
[0006]目前，利用3D类器官模型进行p-gp介导的药物转运的研究已有报道。罗丹明 123 (Rhl23)作为P-gp的底物，被P-gp通过外排作用从培养基（基底侧）中转运至3D类 器官的腔中（肠腔侧）。而且由于Rhl23可以自发荧光，激发波长(λΛ)为485nm，发射波长 (\m)为535nm，这也为Rhl23的检测和定量提供了便利。虽然已有的报道通过荧光定量显 微镜对3D类器官中的Rhl23进行实时监测，根据荧光的强弱来反应其浓度的高低。但是该 方法每次只能对一个3D类器官进行监测，而且每次监测需要在整个实验过程中对荧光强 度进行实时追踪。该方法不仅过程繁琐，而且需要耗费大量的时间。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明提出了一种全新的体外研究P-gp介导 的Rhl23转运的检测方法。该检测方法具有简便、快速、灵敏度高的优点，可利用3D类器官 模型进行P-gp介导的药物转运的研究，也可进行P-gp抑制剂体外筛选的研究。
[0008] 具体地，本发明提出了一种检测3D类器官中P-gp介导的Rhl23转运的方法及应 用。所述方法包括：（1) 3D类器官分别与①P-gp的底物Rhl23②Rhl23和P-gp的抑制剂 共孵育；（2) 3D类器官的收集，超声破碎法使其中的Rhl23释放；(3)在多功能酶标仪上对 Rhl23的荧光强度进行检测，进而可以得知3D类器官中Rhl23的浓度。
[0009] 所述"3D类器官模型"指的是小肠隐窝中的干细胞在基质胶中，利用含有 Responding, m-noggin和m-EGF等生长因子的Advanced DMEM/F12培养基提供必要的营养 成分，进行分化再生而形成的三维的球状结构。所述3D类器官模型中间是由细胞围成的一 个球状空腔，模拟的是小肠的肠腔侧；而外周的突起是由干细胞分化形成的新的隐窝，模拟 的是小肠的基底侧。
[0010]所述p-gp底物包括地高辛（Digoxin)、洛哌丁胺（Loeramide)、奎尼丁 (Quinidine)、长春花碱（Vinblastine)和Rhl23 等；优选使用P-gp底物Rhl23。所述P-gp 底物Rhl23在本发明中的作用是作为一种探针，指示3D类器官中P-gp的活性。Rhl23可被 P-gp从培养基中（基底侧）转运至3D类器官的腔侧（肠腔侧）。在相同的转运时间内，3D 类器官的腔侧Rhl23的浓度的高低与P-gp活性呈正相关。
[0011] 所述p-gp介导的药物指的是可与p-gp的活性位点结合，并借助ATP提供的能量 进行转运的药物。Rhl23作为P-gp的底物，可以与3D类器官上的P-gp结合而被转运。如 当P-gp的活性位点被抑制剂抑制时，P-gp介导的Rhl23转运就会受到限制，3D类器官腔侧 的Rh123浓度就会降低。
[0012] 所述P-gp的抑制剂包括克拉霉素（Clarithromycin)、酮康挫（Ketoconazole)、利 托那韦（Ritonavir)、奎尼丁（Quinidine)和Verapamil等；优选地，所述P-gp抑制剂为维 拉帕米（Verapamil) 〇
[0013] 所述P-gp的抑制剂Verapamil在本发明中的作用是作为一种阳性抑制剂来验证 所建立的方法是否正确可靠，从而保证方法可以用于P-gp抑制剂的筛选。Verapamil作用 机制是与P-gp的底物Rhl23竞争性地结合P-gp的活性位点，从而减弱P-gp对Rhl23的外 排作用，最终导致3D类器官腔侧Rhl23浓度的降低。
[0014] 超声破碎法的具体操作条件为：在400瓦特（W)的工作电压下，超声时间为5秒 (s)，间隙时间为2s，工作次数为3次。
[0015] 3D类器官破碎的程度为：在上述操作条件下，由细胞团状沉淀变成混悬状浊液 时，离心并测定上清中的Rhl23的荧光强度。
[0016] 其中，所述步骤（1)中，3D类器官培养至第三天时，对96板中各个孔的3D类器官 进行计数，然后吸掉培养基；并分别加入新的含药培养基：对照组（Control)只含有Rhl23; 给药组同时含有Rhl23和维拉帕米（Verapamil)，其中Rhl23的浓度为10μM，P-gp抑制剂 Verapamil的浓度为 20μM〇
[0017] 更具体地，所述步骤（1)中在3D类器官培养前包括小鼠小肠隐窝的分选：
[0018] ①取C57BL/6小鼠的小肠，将其分成若干片段，并从中间剪开，用预冷的磷酸盐缓 冲液（Phosphatebufferedsaline，PBS)清洗干净。用盖玻片清除小肠绒毛，并将其转入 含有适量PBS的离心管中，置于冰上。
[0019] ②用含青霉素/链霉素（P/S)的PBS清洗3-4次，再将小肠片段转移至含有EDTA 的PBS中，于4°C冰箱消化。
[0020] ③将消化好的小肠片段转移至离心管，加入含有P/S的PBS，用力地摇晃数次后， 收集悬浮液，用细胞过滤网过滤、离心、沉淀即为小肠的隐窝。
[0021] ④弃上清，用Advanced DMEM/F12培养基重悬沉淀，计数。（培养基中含有 Responding, m-noggin和m-EGF三种生长因子，可诱导小肠细胞的分裂及隐窝的扩增。）
[0022] ⑤取重悬液转移至离心管中，离心。
[0023] ⑥用预冷的基质胶（Matrigel)重悬沉淀并计数，隐窝的数量控制在5-10个/μ1 为最佳（基质胶具有在22-35°C为固态，在4°C为液态的特性）。
[0024] ⑦接板：将96孔板放入细胞培养箱中预热，向每个孔中加入重悬液。
[0025] ⑧将接种好的96孔板放置于细胞培养箱中，使基质胶凝固后加入培养基。
[0026] 更进一步地，所述步骤（1)中，在培养3D类器官后，还包括进一步对3D类器官模 型验证的步骤；包括（i) 3D类器官形态的观察；（ii)mRNA水平上证明3D类器官中P-gp的 表达的量；（iii)免疫组织化学法确证P-gp在3D类器官中表达的位置。
[0027] 其中，所述步骤（i)中，将培养好的3D类器官放置在显微镜下进行观察。
[0028] 其中，所述步骤（ii)中，包括mRNA的提取；以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下 合成cDNA;mdrla引物的设计与验证；mdrla基因的PCR扩增；
[0029] 其中，所述步骤（iii)中，包括将3D类器官的取材与固定；脱水与浸蜡；包埋与切 片；免疫组化，①脱蜡②抗原修复③去除过氧化氢酶④抗