IPTG，继续培养4h，结束发酵。离心收集菌体，进行SDS-PAGE分析。结果显示，目标蛋白在重组大肠杆菌内实现了可溶性表达，且表达量较高。
[0059]将表达菌体重悬于Buffer A(50mmol/L Tris-HCl, 500mmol/L NaCl，ρΗ7.3)中，进行超声破碎^OOW，运行4s、间歇16s，共工作4min)，离心收集破碎液上清，上样于事先经Buffer A平衡过的金属离子(Ν?2+)鳌合层析柱(Chelating Sepharose Fast Flow),再用 Buffer B (50mmol/L Tris-HCl, 500mmol/L NaCl, lOOmmol/L imidazole，pH7.3)洗去杂蛋白，最后通过 Buffer C(50mmol/L Tris-HCl, 500mmol/L NaCl, 200mmol/L imidazole,pH7.3)洗脱，收集目标蛋白洗脱峰。经SDS-PAGE分析，结果显示，目标蛋白在Buffer C洗脱条件下达到电泳纯。
[0060](4)凝血酶切割及三种铅结合蛋白样品制备
[0061]因组氨酸标签可与各种金属离子形成较牢固的配位键，从而对我们的实验造成严重干扰。为了消除这一影响，我们利用存在于组氨酸标签和目标蛋白之间的凝血酶切割位点，进行凝血酶切割实验。将蛋白样品与凝血酶按12.06mo 1: 1U的比例混匀，37 °C水浴，过夜。经Buffer A透析除咪卩坐后，再次上样于经Buffer A平衡过的Ni_IDA，收集透过峰。经SDS-PAGE电泳显示，重组蛋白切割前和切割后存在明显的位移差，表明凝血酶完全可以切除组氨酸标签。将收集到的透过峰，经超滤除盐、浓缩后，替换溶剂为HEPES (pH7.4)，即得目标蛋白样品，用于与金纳米颗粒的偶联。
[0062]3、铅特异性结合蛋白与金纳米粒子的偶联。
[0063]取上述制备的金纳米粒子溶液吸取2mL置于EP管中。离心lOOOOrpm/lOmin，去除上清液。分别加入缓冲液使其分散，再加入上述制备的铅结合蛋白溶液lmL，置于超声波清洗仪中超声lOmin。室温放置使金纳米粒子与铅结合蛋白充分结合。离心，去除未结合蛋白。
[0064]分别加入不同量的铅离子储备溶液稀释至lmL，浓度范围是0.01 μ Μ?20 μ M，超声lOmin，使铅结合蛋白与铅离子充分接触。加入氯化钠盐溶液，超声混匀，观察颜色变化。
[0065]本发明利用对重金属铅离子具有特异性识别功能的铅结合蛋白与金纳米颗粒偶联，构建出重金属铅离子探针，利用铅金属离子与铅结合蛋白的特异性识别作用，可使传感体系的颜色改变，通过肉眼即可达到对铅金属离子的检测。本方法不局限于使用的时间和地点，通过肉眼直接读取实验结果，判定检测结果。这种传感器对于铅离子的检测灵敏度高，特异性好，而且简单方便，肉眼可识别。
[0066]本实验是基于目标检测分子引发纳米粒子聚集而产生颜色变化的比色分析法，比色分析法是纳米传感技术中最先发展起来的技术之一。采用比色分析法仅需要将纳米粒子表面进行功能化修饰使之能够选择性地对目标分子产生响应，直接通过肉眼或简单光谱仪进行检测，即能实现对目标分子的定量分析。这种操作简便且成本低廉的检测方法，已经被普遍应用于各种检测分析研究工作中。利用有机配体、抗体蛋白以及核酸适配体等分子对金纳米粒子进行功能化修饰后，在功能分子发现溶液中含有目标分子后，引起金纳米粒子的聚集，纳米粒子的聚集则引起溶液颜色发生显著性变化，因而这种比色分析法简单快速，且具有较高的选择性和灵敏度。
[0067]以α 2-微球蛋白(a2m)与金纳米粒子偶联得到的传感器为例，通过紫外-可见吸收光谱可以看出，随着铅离子浓度的增加，金纳米颗粒在525nm处的表面等离子吸收峰强度逐渐降低，并出现红移现象，且逐渐在604nm处出现吸收。这是由于铅离子作为桥梁而存在，促使与铅结合蛋白偶联的金纳米颗粒的聚集，从而影响了金纳米粒子的表面等离子吸收峰位，随着金纳米粒子粒径的增加，等离子吸收逐渐红移(如图2)。用肉眼观察金纳米粒子溶液的颜色由粉红色逐渐变为蓝色(图1)。通过干扰离子实验，可以看出常见的金属离子对于我们所构建的铅离子传感器干扰较小(图3)，不会影响其对于铅离子的检测。
[0068]实施例2:
[0069]取9mL CTAB贮备液0.1M，250 μ L氯金酸储备液，600 μ L硼氢化钠溶液混合，25°C反应2小时，制得种子溶液。
[0070]取40mL CTAB储备液，加入2mL氯金酸储备液，400 μ L硝酸银溶液(0.01Μ)，300 μ L抗坏血酸溶液(0.1Μ)，800 μ L盐酸，以及10 μ L种子溶液。在37°C温度下，反应12小时，制得棒状金纳米颗粒。
[0071]取上述制备的棒状金纳米粒子溶液吸取2mL置于EP管中。离心8000rpm/10min，去除上清液。分别加入缓冲液使其分散，再加入上述制备的铅结合蛋白溶液lmL，置于超声波清洗仪中超声lOmin。室温放置使金纳米棒与铅结合蛋白充分结合。离心，去除未结合蛋白。
[0072]分别加入不同量的铅离子储备溶液稀释至lmL，浓度范围是0.01 μ Μ?20 μ M，超声lOmin，使铅结合蛋白与铅离子充分接触，超声混匀，观察颜色变化。
[0073]利用棒状金纳米粒子作为传感器信号源的时候，由于纳米棒的整体粒径大于球状纳米粒子，所以在传感体系遇到铅离子的情况下，更容易产生团聚效果，实验中无需用到氯化钠溶液即可得到与球状金纳米粒子相同的效果。
【主权项】
1.一种快速检测重金属铅离子的方法，其特征在于，采用下述步骤: (1)金纳米粒子的制备； (2)铅特异性结合蛋白的制备； (3)铅特异性结合蛋白与金纳米粒子的偶联。2.根据权利要求1所述的一种检测重金属铅离子的光学传感器构建方法，其特征在于，步骤(1)所述的金纳米粒子为金球形纳米粒子或金棒状纳米粒子中的一种。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的金纳米粒子通过如下方法制备: 金球形纳米粒子:100-200 mL蒸馏水置于一定容量的三颈瓶中，加入0.75-1.5 mL还原剂溶液(0.01?0.5g/mL)，搅拌并加热到20?100 °C，加入2_4 mL氯金酸储备液，调节pH值为9?11，反应25-35 min，溶液成为粉红色，制备结束，保存于4°C备用； 金棒状纳米粒子:取2?10 mL十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)贮备液0.08?0.2 M，100?500 μ L氯金酸储备液0.0025?0.02 Μ，200?800 μ L还原剂溶液混合，20?37°C反应1?3小时，制得种子溶液； 取30?60 mL CTAB储备液，加入1?3 mL氯金酸储备液，200?500 μ L硝酸银溶液(0.005 ?(λ 02 Μ)，200 ?500 μ L 还原剂溶液(0.08 ?(λ 2 Μ)，500 ?800 yL 盐酸，以及5?200 μ L种子溶液，在25?37°C温度下，反应10?20小时，制得棒状金纳米颗粒。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于:所述的还原剂为硼氢化钠、连二亚硫酸盐、亚硫酸盐、亚硝酸盐、维生素C、柠檬酸钠、水合肼、羟胺中的一种。5.如权利要求1-4任何一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中铅特异性结合蛋白的制备，包括:表达载体的构建、融合蛋白的诱导表达和分离纯化、凝血酶切割及蛋白样品制备。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的表达载体的构建为:应用基因重组技术，以金唯智全合成含目的基因的质粒为模板，设计上下游引物，PCR扩增得到目的基因；将表达载体pET28a和目的基因分别经过双酶切、T4连接酶酶连、热转化及测序后，获得序列完全正确的重组大肠杆菌。7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，取测序正确的菌液接种至新鲜LB培养基的三角瓶中，培养至OD为0.6?0.8，加入IPTG，继续培养，结束发酵，离心收集菌体； 将表达菌体重悬于 Buffer A (20mmol/L Tris-HCl, 500mmol/L NaCl, pH7.3)中，超声破碎、离心后，取上清，上样于由Buffer A平衡过的Ni_IDA，再用Buffer B (20mmol/LTris-HCl, 500mmol/L NaCl, lOOmmol/L imidazole, pH7.3)洗去杂蛋白，最后通过 BufferC (20mmol/L Tris-HCl, 500mmol/L NaCl, 200mmol/L imidazole, pH7.3)洗脱，收集目标蛋白洗脱峰。8.根据权利要求3?8任何一项所述的方法，其特征在于所述的氯金酸储备液的浓度为 0.0025 Μ ?0.02 Mo9.根据权利要求3?8任何一项所述的方法，其特征在于:还原剂溶液配制浓度为0.001 ?1 Μ。10.根据权利要求1?9任何一项所述的方法，其特征在于:所述的铅特异性结合蛋白 为α 2-微球蛋白，乙酰辅酶Α结合蛋白3，胸腺素4中的一种。
【专利摘要】本发明属于重金属检测技术领域，涉及一种在线、快速检测重金属铅离子的一种方法。此种方法利用金纳米粒子作为信号传感材料，利用具有对铅离子具有特异性识别功能的蛋白作为铅离子配体，通过配体与铅离子的配位过程引起的金纳米粒子表面等离子共振强度与波长的改变，达到对铅离子进行检测的目的。此种方法反应条件温和，操作简单、安全，重复性好，消除了传统铅离子检测前处理过程复杂，涉及较多仪器设备操作等不便之处。此种方法特异性能好，可广泛应用于食品、化妆品、环境中金属铅离子的快速、便携检测。
【IPC分类】G01N21/78
【公开号】CN105403558
【申请号】CN201510796079
【发明人】王超, 崔勇, 张景海
【申请人】沈阳药科大学
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年11月18日