6的缓冲溶液中，混合搅拌均匀，静置， 取70μ1上清液加入到酶标板中，形成实验对照1、2 (实验对照1在后续步骤添加兔抗桑蚕 丝素蛋白抗体，实验对照2在后续步骤添加兔抗柞蚕丝素蛋白抗体）。取70μ1ΡΗ为7. 4 的PBS缓冲溶液作为空白对照1、2(空白对照与实验对照相对应）用。阴性对照设为不加 一抗，其包被液和实验对照设为一样。然后将各阳性对照，阴性对照，空白对照，实验对照 各放置于4°C冰箱中过夜。
[0041] (3)各孔中加入封闭液200以1。37°(：下封闭1.511。然后吸出孔内液体，用？!1为7.4 的PBS缓冲溶液洗涤3次，每次3min。
[0042] d)分别取用封闭液稀释7000倍的兔抗桑蚕和柞蚕丝素蛋白多克隆抗体70μ1，加 入到酶标板中，保鲜膜封板，37°C下温育1. 5h。然后吸出孔内液体，用ΡΗ为7. 4的PBS缓冲 溶液洗涤3次，每次3min。
[0043] e)各孔中加入用封闭液稀释7000倍的磷酸酯酶山羊抗兔IgG(H+L)抗体70μ1， 37°C下温育1. 5h。然后吸出孔内液体，用PH为7. 4的PBS缓冲溶液洗涤5次，每次3min。
[0044] f)各孔内加底物显色液100μ1，置黑暗处使其反应10min。
[0045] g)各孔内加终止液70μ1，终止反应。
[0046] h)将酶标板置于酶标仪中，读取λ= 450nm处的吸光度数值。
[0047] i)比较实验组测得的0D值。
[0048] 将空白对照的0D均值+3个SD作为cut-off值。
[0049] 若实验对照1的0D均值〉空白对照1的cut-off值，则证明所检测的样品为桑蚕 丝；
[0050] 若实验对照2的0D均值>空白对照2的cut-off值，则证明所检测的样品为柞蚕 丝。
[0051] 实施例3
[0052] -种区分蚕丝种类的检测方法，具体实施步骤如下：
[0053] a)溶液的配制：PBS7. 4 缓冲液配制：KC1 0· 2g，ΚΗ2Ρ04(λ27g，NaCl8. 0g， Na2HP04 ·12Η20 3. 58g，用蒸馏水定容至 1000mL。PBS9. 6 缓冲溶液配制：Na2C03 1. 5g，NaHC03 2. 9g，用蒸馏水定容至1000ml。封闭液（含质量分数1%BSA)配制：BSA0.lg，加PBS7. 4 缓冲液定容至10mL。底物显色液配制：TMB底物溶液与底物缓冲液以1 :1体积混合。终止 液（2mol/LH2S04)配制：蒸馏水178. 90mL，逐滴加入98%硫酸21. 70mL。
[0054] b)将0.lg文物样溶解于1000mLPH为9. 6的缓冲溶液中，混合搅拌均匀，静置，取 100μ1上清液加入到酶标板中，形成实验对照1、2 (实验对照1在后续步骤添加兔抗桑蚕 丝素蛋白抗体，实验对照2在后续步骤添加兔抗柞蚕丝素蛋白抗体）。取100μ1ΡΗ为7. 4 的PBS缓冲溶液作为空白对照1、2(空白对照与实验对照相对应）用。阴性对照设为不加 一抗，其包被液和实验对照设为一样。然后将各阳性对照，阴性对照，空白对照，实验对照 各放置于4°C冰箱中过夜。
[0055] c)各孔中加入封闭液300μ1。37°C下封闭2h。然后吸出孔内液体，用PH为7. 4 的PBS缓冲溶液洗涤3次，每次3min。
[0056] d)分别取用封闭液稀释10000倍的兔抗桑蚕和柞蚕丝素蛋白多克隆抗体100μ1， 加入到酶标板中，保鲜膜封板，37°C下温育2h。然后吸出孔内液体，用PH为7. 4的PBS缓冲 溶液洗涤3次，每次3min。
[0057] e)各孔中加入用封闭液稀释8000倍的磷酸酯酶山羊抗兔IgG(H+L)抗体100μ1， 37°C下温育2h。然后吸出孔内液体，用PH为7. 4的PBS缓冲溶液洗涤5次，每次3min。
[0058] f)各孔内加底物显色液100μ1，置黑暗处使其反应10min。
[0059] g)各孔内加终止液100μ1，终止反应。
[0060] h)将酶标板置于酶标仪中，读取λ= 450nm处的吸光度数值。
[0061] i)比较实验组测得的0D值。
[0062] 将空白对照的0D均值+3个SD作为cut-off值。
[0063] 若实验对照1的0D均值>空白对照1的cut-off值，则证明所检测的样品为桑蚕 丝；
[0064] 若实验对照2的0D均值>空白对照2的cut-off值，则证明所检测的样品为柞蚕 丝。
【主权项】
1. 一种区分蚕丝种类的检测方法，其特征在于利用不同特征多肽制备蚕丝素蛋白特 异抗体来在间接酶联免疫的方法中检测不同种类蚕丝的丝素蛋白成分，即将蚕丝素蛋白洗 脱液包被到酶标板上，然后添加兔抗丝素蛋白抗体与抗原结合形成抗原抗体复合物，洗涤 后加入碱性磷酸酯酶标山羊抗兔IgG(H+L)抗体，形成抗体-抗原-抗体复合物，洗涤加入 TMB显色液，底物被酶催化为有色产物，根据产物颜色变化的深浅可进行定性分析。2. 根据权利要求1所述的区分蚕丝种类的检测方法，其特征是：根据桑蚕丝素蛋白和 柞蚕丝素蛋白的氨基酸序列区别设计合成序列为"MQRKNKNHGILGKC"的多肽作为桑蚕丝素 蛋白特异抗体，设计合成序列为"CSHSHSYEASRISVH"的多肽作为柞蚕丝素蛋白特异抗体。3. 根据权利要求1所述的区分蚕丝种类的检测方法，其特征在于包括如下步骤： a) 溶液的配制：PBS7. 4 缓冲液配制：KC1 0· 2g，ΚΗ2Ρ04 0· 27g，NaCl8.Og， Na2HP04 ·12Η20 3. 58g，用蒸馏水定容至lOOOmL;PBS9. 6 缓冲溶液配制：Na2C03 1. 5g，NaHC03 2. 9g，用蒸馏水定容至1000ml; 封闭液（含质量分数1 %BSA)配制：BSA0.lg，加PBS7. 4缓冲液定容至lOmL; 底物显色液配制：TMB底物溶液与底物缓冲液以1 :1体积混合； 终止液（2mol/LH2S04)配制：蒸馏水178. 90mL，逐滴加入98%硫酸21. 70mL; b) 将0. 01g-0.lg文物样溶解于lOO-lOOOmLPH为9. 6的缓冲溶液中，混合搅拌均 匀，静置，取50-120μ1上清液加入到酶标板中，形成实验对照1、2 ;实验对照1在后续步 骤添加兔抗桑蚕丝素蛋白抗体，实验对照2在后续步骤添加兔抗柞蚕丝素蛋白抗体；取 50-120μ1ΡΗ为7. 4的PBS缓冲溶液作为空白对照1、2 (空白对照与实验对照相对应）用； 阴性对照设为不加一抗，其包被液和实验对照设为一样；然后将各阴性对照，空白对照，实 验对照各放置于4°C冰箱中过夜； c) 各孔中加入封闭液100_300μ1，37°C下封闭l_2h，然后吸出孔内液体，用PH为7. 4 的PBS缓冲溶液洗涤3次，每次3min; d) 分别取用封闭液稀释1000-12000倍的兔抗桑蚕和柞蚕丝素蛋白多克隆抗体 50-120μ1，加入到酶标板中，保鲜膜封板，37°C下温育l_2h，然后吸出孔内液体，用PH为 7. 4的PBS缓冲溶液洗涤3次，每次3min; e) 各孔中加入用封闭液稀释3000-10000倍的磷酸酯酶山羊抗兔IgG(H+L)抗体 50-120μ1，37°C下温育l_2h，然后吸出孔内液体，用PH为7. 4的PBS缓冲溶液洗涤5次，每 次 3min; f) 各孔内加底物显色液100μ1，置黑暗处使其反应l〇min; g) 各孔内加终止液50-120μ1，终止反应； h) 将酶标板置于酶标仪中，读取λ= 450nm处的吸光度数值； i) 比较实验组测得的0D值； 将空白对照的0D均值+3个SD作为cut-off值； 若实验对照1的0D均值>空白对照1的cut-off值，则证明所检测的样品为桑蚕丝； 若实验对照2的0D均值>空白对照2的cut-off值，则证明所检测的样品为柞蚕丝。
【专利摘要】本发明公开了一种区分蚕丝种类的检测方法,利用不同特征多肽制备蚕丝素蛋白特异抗体来在间接酶联免疫的方法中检测不同种类蚕丝的丝素蛋白成分，即将蚕丝素蛋白洗脱液包被到酶标板上，然后添加兔抗丝素蛋白抗体与抗原结合形成抗原抗体复合物。洗涤后加入碱性磷酸酯酶标山羊抗兔IgG(H+L)抗体，形成抗体-抗原-抗体复合物，洗涤加入TMB显色液，底物被酶催化为有色产物，根据产物颜色变化的深浅进行定性分析。该方法操作简单，灵敏度高，优于常规检测方法。
【IPC分类】G01N33/68
【公开号】CN105424943
【申请号】CN201510769490
【发明人】游秋实, 王秉, 万军民, 胡智文
【申请人】浙江理工大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年11月12日