3杯/天，持续 16-30天/月。
[0214]关于年龄、性别、种族、口腔卫生(掉落的牙齿数目）、吸烟史、饮酒习惯或他们是从 县医院(JMH)抑或私人医院(UM)系统招募，在病例与对照之间不存在显著差异。表10显示病 例中的癌症特异性特征。0P患者很可能处于晚期（ΠΙ/IV对比I/II;p〈.0001)，与0C患者相 比显示更高级的N-状态(N1-N3对比NO，Nx;p〈 · 0001)且具有HPV+比对HPV-肿瘤(p〈 · 001)。 [0215] 表10.在150个病例中由疾病部位确定的阶段和HPV状态
[0218] Log2CD44 (下文称为⑶44)和总蛋白是在病例和对照组内关于风险因素或人口统 计变量来评估(表11)。当考虑了年龄、性别、种族/人种、吸烟习惯或饮酒习惯、牙齿脱落或 漱口能力时，CD44和蛋白水平在p〈0.05下在病例中与对照相比更高。CD44水平在病例组中 而不是在对照组中随年龄(在年长的患者中水平更高）、嗽口（在漱口能力较差时，水平更 高）、及牙齿脱落(在牙齿脱落较多时，水平更高)而显著不同。CD44和蛋白的水平并不因TNM 状态或HPV状态而显著不同。
[0219] 表11在由患者组和关键变量确定的R01HNSCC研究的口腔漱洗液中的l〇g 2S〇 1CD44 和蛋白水平
[0221] 表11在由患者组和关键变量确定的R01HNSCC研究的口腔漱洗液中的l〇g2S〇 1CD44 和蛋白水平
[0223] 表11在由患者组和关键变量确定的R01HNSCC研究的口腔漱洗液中的l〇g 2S〇lCD44 和蛋白水平
[0225] 表11在由患者组和关键变量确定的R01HNSCC研究的口腔漱洗液中的l〇g 2S〇lCD44 和蛋白水平
[0227] 表11在由患者组和关键变量确定的R01HNSCC研究的口腔漱洗液中的l〇g 2S〇 1CD44 和蛋白水平
[0229] 表11在由患者组和关键变量确定的R01HNSCC研究的口腔漱洗液中的l〇g 2S〇 1CD44 和蛋白水平
[0231] 表11在由患者组和关键变量确定的R01HNSCC研究的口腔漱洗液中的l〇g 2S〇 1CD44 和蛋白水平
[0233] 表11在由患者组和关键变量确定的R01HNSCC研究的口腔
[0234] 漱洗液中的log2S〇lCD44和蛋白水平
[0236] 风险建模
[0237] 在单变量分析中，CD44和总蛋白将癌症病例与对照区分开，其中优势率是：在 2.036的0)44中有一个单位的增加（95%(：1 :1.552,2.6714〈0.000141^ = 0.68)且在2.159 的蛋白中有一个单位的增加(95%CI :1.288,3.617，p〈0.0035，AUC = 0.59)。在对重要变量 及其相互作用调整之后，AUC提高至0 · 757 ; CD44的OR增至2 · 668(95 %CI: 1 · 794，3 · 968p〈 ? 0001)，而蛋白的优势率变得小于1且无显著性（〇R = 〇.661，95%CI :0.312，1.399，p = 0.279)(表 12 组 A)。
[0238] 在患有口咽HNSCC的不吸烟者中常见的HPV+肿瘤与烟草和酒精诱发的肿瘤相比具 有较佳预后。由P16INK4A (代替HPV状态)分层的分析的研究结果类似于组合分析(Haf kamp 等人International Journal of Cancer2008;122:2656-64;E1-Naggar等人Head Neck. 2012,34:459-61)。在HPV组中，蛋白水平与多变量分析之后的显著保护作用有关(表 12组幻。
[0239]将多变量递归分割和逻辑回归分析用于更好地理解CD44、蛋白与疾病存在预测之 间的关系（表12组C)。分类树基于⑶44和蛋白的2个切割点产生5个显著风险组，分类为组1 (CD44〈2 · 22ng/mL和蛋白〈1 · 23mg/mL，η = 102)和组4(CD44 2 2 · 22&〈5 · 33ng/mL和蛋白 > 0 · 558mg/mL，η = 116)中的"对照"受试者；以及组2(CD44〈2 · 22ng/mL和蛋白 2 1 · 23mg/mL，η =5)、组3 (CD44 2 2 · 22&〈5 · 33ng/mL和蛋白〈0 · 558mg/mL，η = 20)和组5 (CD44 2 5 · 33ng/mL， 不管蛋白水平，n = 57)中的"病例"受试者(表12组〇』044 2 5.331^/1^(不管蛋白水平)与 病例状况高度相关(〇R= 11.830，95%CI: 5.279，26.508 ;p〈0.0001，比较组5对比组1作为参 考）。当CD44低于5.33ng/mL时，蛋白有助于确定风险的量级。例如，具有CD44〈2.22ng/mL和 蛋白>2 1.23mg/mL的患者（组2)与组1中的患者相比具有作为病例的显著更高风险（OR = 10 · 069，95 % Cl: 1 · 079，93 · 93，p〈0 · 05)。具有CD44 2 2 · 22&〈5 · 33ng/mL和蛋白小于0 · 558mg/ mL的患者（组3)与组1相比也具有作为病例的显著更高风险(0R=10.069,95%CI:3.103， 32 · 672，p = 0 · 0001)。对于具有CD44 2 2 · 22ng/mL&〈5 · 33ng/mL和蛋白 2 0 · 558mg/mL的患者 (组4)，观察到作为病例的较低但显著的风险（OR=2. 192,95%CI:1.247,3.854，p = 0.006)。从包括人口统计和风险因素的多变量模型推导出的OR显示⑶44水平2 5.33ng/mL 仍然与病例状况高度相关（调整的〇1?=14.714,95%(：1:6.094,35.527;?〈.0001)且总蛋白 水平帮助预测病例状况(表12组C)。
[0240] 表12.预测模型
[0243] 标准逻辑回归，通过HPV状态来分层
[0244]
[0249] 逻辑回归模型包括CD44-蛋白风险组（5类，p〈0.0001)、年龄U 60对比<60，p = 0.060)、性别（男性对比女性，p = 0.016)、种族/人种(WNH和WH对比黑人，p = 0.0027)、饮酒 (曾有对比从不，P = 〇.0103)、以及相互作用种族/人种X年龄(p = 0.0138)和性别X饮酒(p = 0.0063)。吸烟（曾有比对从不，p = 0.844)和牙齿脱落(6颗或更多颗或全部比对5颗或5颗 以下，p = 0.274)不被纳入模型中，由于其纳入不会提高模型拟合。
[0250] 表11组A显示更高百分比的HPV+受试者在风险组3中，而更高百分比的HPV-受试者 在风险组4中。患有阶段IV疾病的患者在风险组1或5中与患有不算晚期的肿瘤的患者相比 更常见(表13,组A)。
[0251] 表13.在检测和确定HNSCC预后中的Sol⑶44/总蛋白测试
[0252] A.由HPV状态和阶段确定的每个风险组中的病例百分比
[0254] B.无进展存活率和总存活率
[0257] ^FS的Cox成比例危险模型包括风险组(5类，p = 0.0181)、阶段（III/IV对比1/11， p = 0.0117)、种族（黑人对比其他，p = 0.0066)、人种（非西班牙人对比西班牙人，p = 0.5964)、性别（女性比对男性，p = 0.5779)、以及年龄(p = 0.2112)。
[0258] 20S的Cox成比例危险模型包括风险组(5类，p = 0.0750)、阶段（III/IV对比I/II，p =0.0315)、种族（黑人对比其他，p = 0.0041 )、人种（非西班牙人对比西班牙人，p = 0.1091)、性别（女性比对男性，p = 0.2663)、以及年龄(p = 0.0725)。
[0259] 表 13(续）
[0260] C.使用回归树模型的灵敏度和特异性 [0261] 灵敏度
[0265] 标记物的预后意义
[0266] 由风险组确定的无进展存活率(PFS)和总存活率(0S)的Kaplan-Meier曲线展示于 图5A和图5B中。由风险组确定的PFS和0S的未调整的和调整的危险比率(HR)估算值展示于 表13组B中。基于肿瘤阶段、年龄、性别、种族和人种有调整的多变量分析，分到风险组5(高 CD44)中的基于医院的病例与风险组1中的病例相比具有减小的PFS(调整的HR = 3.588， 95%(：1:1.558,8.265卬=0.0027)和05(调整的册=2.882,95%(：1:1.165,7.130卬= 0.0220)。风险组2与减小的？？5具有临界相关性（册=3.863,95%(：1 :0.966，15.445，口 = 0.056)且在03中与风险组1中的病例相比无显著差异(冊=2.406,95%(：1:0.579,9.990，？ =0.2268);然而，此组仅包括4个病例。
[0267] 灵敏度和特异性
[0268] 用于预测病例状况的灵敏度是80.7% (表13C)。这在2006基于医院的研究中是证 实的（灵敏度77.8% )。33对于2012基于医院的病例，灵敏度在阶段I-III癌症中达到了88% (表13C)。特异性在基于医院的对照、处于HNSCC的高风险下的社区(n = 150,98%吸烟者，卫 生条件恶劣)及主要是非吸烟者的正常志愿者中得到证实(表13C)。特异性在正常志愿者群 组中是最大的(95.2%)。在进一步的评价中，发现超过10%基于医院的对照对比小于1%社 区群组具有UADT之外的早先癌症病史。具有早先癌症病史的基于医院的对照与没有早先癌 症的对照相比具有显著更高的solCD44(p〈0.05)。
[0269] 风险的逆转
[0270]在基于社区的群组中总共有95名患者提供基线和年度随访收集物。在1年内CD44 和蛋白水平的变化分布分别展示于图5C和5E中。平均CD44水平在基线处是1.829ng/mL且在 1年随访时是1.390叫/11^。-0.439叫/11^(24%)的0044水平的年平均下降是显著的（？〈 .0001)。线性回归分析证实了对于较低⑶44值的显著线性趋势(R2 = 0.227，截距=0.785(p 〈.0001)，斜率=0.331 (p〈. 0001))(图。平均蛋白水平也从0.644显著地下降到0.543mg/ mL(p = 0.036)，通过线性回归分析来证实（R2 = 0.108,截距= 0·284(ρ = 0·002)，斜率= 0.402(p〈.0001))(图5F)。为了确定这些改变是否归因于在测定条件下一年过程中的变化， 将基线第二等分试样(基线2)在与年度随访收集相同的板上进行，其中81个这种配对用于 每个测定(蛋白和⑶44)。在基线2与每年随访之间的水平下降仅对于⑶44是显著的(0044:_ 0.296即/1111^ = 0.023;蛋白：-0.01311^/1]11^ = 0.796)，而线性回归显示朝向两种标记物的 较低数量的显著趋势(〇044:1?2 = 0.227，截距=0.882(?〈.0001)，斜率=0.288(?〈.0001); 蛋白，R2 = 0.155,截距= 0·256(ρ = 0·008)，斜率=0.534(?〈.0001)。通过基线2在基线1上 的线性回归比较两条基线。对于CD44,相关性是高的(R = 0.899)，截距不是显著不同于零(ρ = 0.150)且斜率不是显著不同于1(ρ = 0.881)，指示这两个是等效物。对于蛋白，相关性也 是高的（R = 〇. 925)，截距不是显著不同于零（p = 0.712)，但斜率显著不同于1(0.85，p〈 .001)，指示蛋白的基线之间的差异不在预期的随机变化内。
[0271 ] 在中度(风险组4，n = 14)或高风险（风险组2，n = 1，风险组3n = 5以及风险组5n = 2)的22名社区受试者中，1年随访之后仅有5名保留在风险类别(风险组4，n = 3,风险组2n = 1，风险组5n = l)中。
[0272] CD44在检测口腔癌或其他部位处的癌症中的作用
[0273] 2名受试者落入升高的风险类别（都是风险组4)中且在随访中发展早期HNSCC(唇 和喉的原位癌）。一个对照因为膀胱癌而被排除，其具有14ng/mL的solCD44水平和1.5mg/mL 的蛋白水平。另一对照由于口腔初癌的关系而被排除，其具有4.8ng/mL的solCD44水平和 1.3mg/mL的蛋白水平并且继续发展成肺癌。来自基于社区的研究的一个患者发展成肺癌并 且在诊断之前14个月具有升高的水平(CD44 = 3.975ng/mL，蛋白=0.656mg/mL)。
[0274] 讨论
[0275]本文所公开的方法显示一种基于⑶44和蛋白的便宜的非侵入式筛选工具，其能够 将口腔癌病例与对照准确地区分开。本文所独有的频率匹配防止因协变量如吸烟或社会经 济状况所致的混淆。在美国有超过8500万个体处于口腔癌的风险中，但这些脆弱的个体中 几乎没有人实际上接受口腔检查。本文所述的口腔漱洗液分子测试可通过提供口腔癌风险 的简单和可靠的量度来改革口腔癌筛选，其提醒初级护理提供者和牙科医生关于最需要熟 练的口腔检查的个体。CD44ELISA测定和蛋白测试早已被转化为侧向流测试条原型。因此， 普查是可行的。
[0276] 研究还显示高⑶44与不良的PFS和0S有关。这些标记物可适用于指导疗法(Ang等 人N Engl J Med.2010 1;363:24-35)该测试可检测早期（I-III) 口腔癌超过晚期（IV)疾 病。CD44的作用对于肿瘤起始来说可能很重要。
[0277]在此研究中被认为是假阳性的两个患者在随访期间发展成HNSCC(Franzm ann等 人Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2007; 16:1348-55)。此外，患有包括肺和膀脫的其 他吸烟相关肿瘤的受试者也具有升高的CD44水平。因此，"假阳性"可实际上是对于具有相 关风险因素的隐匿性口腔疾病或其他癌症的真阳性。由于CD44是肿瘤起始因子，所以如果 风险因素减少且隐匿性病变消失，那么水平便可下降。数据显示留在社区筛选计划中一年 的个体经历了 CD44水平的显著下降。所有受试者都接受了关于戒烟的教育并且可利用资源 来帮助他们改善口腔卫生和营养。因此，行为变化可造成水平降低。
【主权项】
1. 一种确定受试者的癌症风险的方法，其包括： a) 测量来自所述受试者的体液样本中so 1CD44的测试量； b) 测量所述样本中总蛋白的测试量； c) 提供solCD44的参考水平和总蛋白的参考水平，其中solCD44和总蛋白的参考水平是 通过使用来自健康个体及患有癌症个体的群体的so 1CD44和总蛋白水平来测定，并且其中 S〇lCD44和总蛋白的参考水平划定关于所述癌症的不同的统计上显著的风险；以及 d) 通过确定S〇lCD44的测试量和总蛋白的测试量是高于或是低于S〇lCD44和总蛋白的 参考水平来确定所述受试者的癌症风险。2. 如权利要求1所述的方法，其中在所述群体中的个体具有与受试者的社会人口统计 和风险因素类似的年龄、种族、饮酒史、吸烟史、和/或癌症病史。3. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述群体中的个体具有与受试者的社会 人口统计和风险因素类似的人类乳头状瘤病毒(HPV)感染状况。4. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述体液选自由以下组成的组：口腔漱 洗液、唾液、痰液、呼吸气冷凝液、血液、血浆、血清、以及尿。5. 如权利要求4所述的方法，其中所述口腔漱洗液是口腔盐水漱洗液。6. 如权利要求4所述的方法，其中所述口腔漱洗液是在所述受试者吃饭、吸烟、及饮水 之后至少一小时获得。7. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症是头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。8. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症是肺癌、前列腺癌、结肠癌、膀 胱癌、黑色素瘤、白血病/淋巴瘤、乳腺癌、或骨肉瘤。9. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中基于受试者年龄、种族、饮酒史、吸烟史、 癌症病史和/或人类乳头状瘤病毒(HPV)测定的阳性结果选出所述受试者以提供口腔漱洗 液。10. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者没有临床上明显的恶性肿 瘤或初癌。11. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是基于所鉴别的风险通过 手术、放射线、或化学疗法、或其组合来治疗。12. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在确定癌症风险之前，将S〇lCD44的测 试量针对总蛋白的测试量进行标准化。13. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中免疫测定是用于测量所述样本中 solCD44的测试量。14. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中免疫测定是用于测量来自所述群体的 solCD44 水平。15. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于测量所述样本中S〇lCD44的测试量 和/或来自所述群体的s 〇lCD44水平的所述免疫测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)或侧流测 定。16. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中劳瑞或改性劳瑞蛋白测定是用于测量 所述样本中总蛋白的测试量。17. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中劳瑞或改性劳瑞蛋白测定是用于测量 来自所述群体的总蛋白水平。18. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者提供风险因素管理 咨询。19. 如权利要求18所述的方法，其中所述风险因素管理咨询包括戒烟计划20. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括以固定的时间间隔重复步骤a)至 d) 〇21. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中每三至六个月重复步骤a)至d)。22. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括步骤e)把所述受试者送交癌症专 家。23. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括测量所述样本中透明质酸(HA)和 透明质酸酶(HAas e)中的至少一个的水平。24. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中solCD44的参考水平为约10ng/mL、约 5 · 5ng/mL、约5 · 3ng/mL、和/或约2 · 2ng/mL。25. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中总蛋白的参考水平为约1.5mg/mL、约 1 · 2mg/mL、和/或约 0 · 6mg/mL。26. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中solCD44的参考水平为约2.2ng/mL和约 5.3ng/mL并且总蛋白的参考水平为约1.2mg/mL。27. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中solCD44的参考水平为约2.2ng/mL和约 5.3ng/mL并且总蛋白的参考水平为约0.5mg/mL。28. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中solCD44和总蛋白的参考水平分别为约 2 · 22ng/mL 和约 1 · 2mg/mL。29. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中统计分析是用于测定参考水平。30. 如权利要求29所述的方法，其中统计分析包括多变量分析或逻辑回归计算。31. -种试剂盒，其包括:盐水溶液;用于接收口腔盐水漱洗液的杯子;至少一种特异性 地结合CD44的抗体；用于测定总蛋白浓度的试剂；以及 S〇lCD44和总蛋白的参考水平，其中 sol⑶44和总蛋白的参考水平是通过使用来自健康个体和患有癌症个体的群体的S〇lCD44 和总蛋白水平来测定，并且其中 S〇lCD44和总蛋白的参考水平划定关于所述癌症的不同的 统计上显著的风险。32. 如权利要求31所述的试剂盒，其还包括至少一种结合pl6INK4a的抗体。33. 如权利要求31或32所述的试剂盒，其中所述至少一种特异性地结合pl6INK4a的抗 体包括E6H4抗体克隆的个体遗传型。34. 如权利要求31-32中任一项所述的试剂盒，其还包括⑶44参考样本、pl6参考样本、 或其组合。35. 如权利要求31-34中任一项所述的试剂盒，其还包括用于检测特异性地结合 p 16 INK4a的抗体、特异性地结合⑶44的抗体、或其组合的一种或多种比色剂。36. 如权利要求31-35中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒是侧流免疫测定。37. 如权利要求31-36中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括任选地涂覆有以下 的多孔板:特异性地结合pl6INK4a的抗体、特异性地结合CD44的抗体、或其组合。38. 如权利要求31-37中任一项所述的试剂盒，其中solCD44的参考水平为约10ng/mL、 约5 · 5ng/mL、约5 · 3ng/mL、和/或约2 · 2ng/mL。39. 如权利要求31-38中任一项所述的试剂盒，其中总蛋白的参考水平为约1.5mg/mL、 约1 · 2mg/mL、和 / 或约 0 · 6mg/mL。40. 如权利要求31-39中任一项所述的试剂盒，其中solCD44的参考水平为约2.2ng/mL 和约5.3ng/mL并且总蛋白的参考水平为约1.2mg/mLD41. 如权利要求31-40中任一项所述的试剂盒，其中solCD44的参考水平为约2.2ng/mL 和约5.3ng/mL并且总蛋白的参考水平为约0.5mg/mLD42. 如权利要求31-41中任一项所述的方法，其中solCD44和总蛋白的参考水平分别为 约2 · 22ng/mL 和约 1 · 2mg/mL。
【专利摘要】本文公开了使用来自受试者的体液样本及标记物如solCD44和总蛋白的测定来确定受试者的癌症如头颈部鳞状细胞癌的风险的组合物和方法。还公开了基于所述风险治疗受试者的方法。还公开了确定癌症治疗功效的方法。
【IPC分类】G01N33/574
【公开号】CN105556312
【申请号】CN201480050455
【发明人】E·弗兰兹曼
【申请人】迈阿密大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年7月31日
【公告号】CA2919975A1, EP3028047A1, US20160187343, WO2015017692A1