用于肾损伤和肾衰竭的诊断及预后的方法和组合物的制作方法
【专利说明】用于肾损伤和肾衰竭的诊断及预后的方法和组合物
[00011 本申请要求2013年6月5日提交的美国临时专利申请No. 61/831，294和2013年8月6 日提交的美国临时专利申请No. 61/862，913的优先权，上述每个申请在此整体并入本文。
[0002] 发明背景
[0003] 提供对本发明背景的以下讨论仅仅用于帮助读者理解本发明而并非承认描述或 构成本发明的现有技术。
[0004] 肾脏负责从体内排泄水和溶解物。它的功能包括维持酸碱平衡、调节电解质浓度、 控制血容量和调节血压。因此，肾脏功能因损伤和/或疾病的丧失导致大量的发病及死亡。 肾损伤的详细论述提供在Harrison的Principles of Internal Medicine，第17版，McGraw Hill，New York，第1741-1830页中，该文献在此以引用的方式整体并入。肾病和/或肾损伤 可为急性的或慢性的。急性和慢性肾病描述如下（来自Current Medical Diagnosis& Treatment 2008,第47版，McGraw Hill，New York，第785-815页，该文献在此以引用的方式 整体并入）："急性肾衰竭是肾功能在几小时至几天内恶化，导致含氮废物(如脲氮)和肌酐 滞留在血液中。这些物质的滞留被称为氮质血症。慢性肾衰竭(慢性肾病）因肾功能在几个 月至几年内的异常丧失而引起。"
[0005] 急性肾衰竭(ARF，也称为急性肾损伤，或AKI)是肾小球过滤急剧(一般在约48小时 至1周内检测出）降低。该过滤能力的丧失导致由肾脏正常排泄的含氮(脲和肌酐)和不含氮 废物的滞留、尿排出量减少，或两者兼而有之。据报道，ARF使约5 %入院，4-15 %心肺旁路手 术，及多达30%重症监护治疗恶化。ARF按起因可分为肾前性、肾因性或肾后性ARF。肾因性 疾病可进一步分为肾小球异常、肾小管异常、间质异常和血管异常。ARF的主要原因描述于 下表中，该表改自Merck Manual，第17版，第222章，其在此以引用的方式整体并入。
[0008] 在缺血性ARF的情况下，病程可分成四个阶段。在持续几小时至几天的起始阶段期 间，肾脏灌注降低正发展为损伤。肾小球超滤减少，滤液流量因肾小管内的碎片而减少，并 且滤液通过受损的上皮发生回漏。此阶段期间，肾损伤可通过肾脏再灌注而被介导。起始之 后是扩展阶段，该阶段的特征是持续的缺血性损伤和炎症，并且可能涉及内皮损伤和血管 充血。在持续1至2周的维持阶段期间，肾细胞出现损伤，并且肾小球过滤和尿排出量达到最 小。随后可以是恢复阶段，其中肾上皮细胞得以被修复，GFR逐渐复原。尽管如此，但患有ARF 的受试者的存活率可能还是低至约60%。
[0009] 因放射造影剂(也称为造影介质）及其它肾脏毒素（如环孢霉素）、抗生素(包括氨 基糖苷类)和抗癌药(如顺铂）引起的急性肾损伤在几天至大概一周的时间段内显现出来。 造影诱发的肾病(CIN，其是由放射造影剂引起的AKI)被认为是由肾内血管收缩(导致缺血 性损伤)且因产生对肾小管上皮细胞具有直接毒性的活性氧类而引起的。CIN传统上表现为 血脲氮和血清肌酐的急性(24-48h内发作)但可逆(3-5天达到峰值，1周内消退)的升高。
[0010] 通常报导的用于确定和检测AKI的标准是血清肌酐的急剧(一般在约2-7天内或在 住院期间内）升高。虽然使用血清肌酐的升高来确定和检测AKI已得到良好的确定，但血清 肌酐升高的幅度和定义AKI的测量时间在出版物之间却有很大的差异。传统上，血清肌酐相 对大的增长（如1〇〇%、200%、至少100%的增长到211^/北以上的值及其它定义）用于定义 AKI。然而，目前的趋势是使用较小的血清肌酐升高来定义AKI。血清肌酐升高、AKI与相关的 健康风险之间的关系的综述见于Praught和Shlipak，Curr Opin Nephrol Hypertens 14: 265-270,2005和Chertow等，J Am Soc Nephrol 16:3365-3370,2005中，上述文献与其中所 列的参考文献在此以引用的方式整体并入。如这些出版物中所述，现在已知急性恶化的肾 功能(AKI)和增加的死亡风险及其它不利的结果与血清肌酐的极小增长有关。这些增长可 确定为相对(百分比）值或标称值。已报道，血清肌酐较损伤前的值相对增长低至20%就表 明了急性恶化的肾功能(AKI)和增大的健康风险，但更常见报道的定义AKI和增大的健康风 险的值是至少25%的相对增长。已报道，低至0.311^/(11^、0.211^/(11^或甚至0.111^/(1]^的标称增 长表明有恶化的肾功能和增大的死亡风险。已经用血清肌酐升至这些阈值的不同时间段来 定义AKI，例如范围为2天、3天、7天或定义为患者住院或入住重症监护病房时间的可变时间 段。这些研究表明，对于恶化的肾功能或AKI，没有特定的血清肌酐升高阈值(或升高所用的 时间段），而是风险性随血清肌酐升高幅度的增加而连续增大。
[0011] -项研究（Lassnigg等，J Am Soc Nephrol 15:1597-1605，2004,其在此以引用的 方式整体并入)对血清肌酐的增加和减少进行了研究。心脏手术后具有-0.1至-〇.3mg/dL的 血清肌酐轻微下降的患者死亡率最低。血清肌酐下降较大(超过或等于-〇.4mg/dL)或血清 肌酐有任何增长的患者死亡率较高。这些研究结果使作者得出结论，即使肾功能的非常微 小的变化(如手术48小时内通过肌酐较小变化所检测到的）也严重影响患者的结果。为了对 用于在临床试验和临床实践中利用血清肌酐来定义AKI的统一分类系统达成共识，Bellomo 等(Crit Care.8(4):R204-12,2004,其在此以引用的方式整体并入)提出了用于将AKI患者 分级的以下分类：
[0012] "风险"：血清肌酐较基线增长1.5倍，或尿生成<0.5ml/kg体重/h，持续6小时；
[0013] "损伤"：血清肌酐较基线增长2.0倍，或尿生成〈0.5ml/kg/h，持续12小时；
[0014] "衰竭"：血清肌酐较基线增长3.0倍，或肌酐>355μπι〇1/1(升高>44)，或尿排出量低 于0.3ml/kg/h持续24小时，或无尿持续至少12小时；
[0015] 并包括两种临床结果：
[0016] "丧失"：对肾替代疗法的持续需求超过四周。
[0017] "ESRD" ：晚期肾病-对透析的需求超过3个月。
[0018] 将这些标准称作RIFLE标准，这些标准提供了对肾状态进行分类的有用的临床工 具。如Kellum，Crit·Care Med·36:S141-45，2008和Ricci等，Kidney Int·73，538-546，2008 中所述(各自在此以引用的方式整体并入），RIFLE标准提供了已在许多研究中得到确认的 AKI的统一定义。
[0019] 最近，Mehta等，Crit.Carell:R31(doi :10.1186.cc5713)，2007(此文献在此以引 用的方式整体并入)提出了用于将AKI患者分级的以下类似分类，其修改自RIFLE:
[0020] "阶段Γ :血清肌酐增长超过或等于0.3mg/dL( 2 26.4μηιο1/υ，或增至超过或等于 基线的150% (1.5倍），或尿排出量少于0.5mL/kg/小时持续超过6小时；
[0021] "阶段II"：血清肌酐增至超过基线的200%(>2倍），或尿排出量少于0.5mL/kg/小 时持续超过12小时；
[0022] "阶段III" ：血清肌酐增至超过基线的300% (>3倍），或血清肌酐2 354ymol/L，伴 有至少44ymol/L的急性增长，或尿排出量少于0.3mL/kg/小时持续24小时，或无尿持续12小 时。
[0023] CIN协调工作组（McCollough等，Rev Cardiovasc Med.2006;7(4): 177-197,在此 以引用的方式整体并入）用25%的血清肌酐升高来定义造影剂诱发的肾病(其是一种类型 的AKI)。虽然各组提出的用血清肌酐检测AKI的标准略有不同，但共识是血清肌酐的较小变 化(如〇.3mg/dL或25%)足以检测AKI(恶化的肾功能），并且血清肌酐变化幅度是AKI严重程 度和死亡风险的指标。
[0024] 虽然在若干天内连续测量血清肌酐被接受为一种检测和诊断AKI的方法，并且被 认为是用于评价AKI患者的最重要的工具之一，但一般认为血清肌酐在诊断、评估和监测 AKI患者时有一些局限性。血清肌酐升至被视为AKI诊断值(例如，0.3mg/dL或25 %的升高） 的时间段可为48小时或更长，这取决于所用定义。由于AKI中的细胞损伤可在数小时内发 生，因此在48小时或更久所检测到的血清肌酐升高可能是损伤的晚期指标，并且因此依赖 血清肌酐可能延误AKI的诊断。此外，当肾功能快速变化时，血清肌酐并非是精确的肾脏状 态及AKI最急性阶段期间的治疗需求的良好指标。一些AKI患者会完全恢复，一些将需要透 析(短期或长期），而一些则会有其它不利的结果，包括死亡、严重的不良心脏事件和慢性肾 病。因为血清肌酐是过滤速度的指标，所以它并不区分AKI的起因（肾前性、肾因性、肾后性 梗阻、粥样栓塞性等)或肾因性疾病中损伤的类别或位置(例如，起源于肾小管、肾小球或间 质）。尿排出量受到类似的限制，了解这些事情对管理和治疗AKI患者而言是至关重要的。
[0025] 这些限制强调了需要更好的方法来检测和评估AKI，特别是在早期和亚临床阶段， 以及在可能出现肾脏恢复和修复的后期。此外，需要更好地鉴别处于患有AKI风险的患者。 [0026] 发明概述
[0027] 本发明目的是提供肾功能的功能评估连同生物标记物结果的组合，以改善处于急 性肾损伤风险或者具有急性肾损伤的患者的评估。袢利尿剂例如呋塞米抑制整个髓袢升支 粗段中的腔内氯化物主动转运，从而防止钠重吸收并导致尿钠排泄和尿流增加。袢利尿剂 诱导的尿排出量增加可能是在早期AKI环境下评估肾小管功能完整性的方法，因此作为肾 小管功能临床评估的肾对利尿剂激发的响应或其缺乏可以在其临床显现(例如肌酐升高） 之前鉴别具有严重肾小管损伤的患者。
[0028] 然而，因为根据定义，袢利尿剂的施用是有可能具有不希望的全身效应的介入程 序，本发明依赖于对获自患者的液体样品的初始生物标记物测定，以提供患者急性肾损伤 风险的初始评估。通过使生物标记物测定结果与患者的急性肾损伤风险相关联，确定患者 接受利尿应激评价的适合性;实际上，如果患者的生物标记物结果指示急性肾损伤的实质 风险，则对随后利尿应激评价的需求降低，并且患者可以基于生物标记物结果指示的风险 来治疗。如果生物标记物结果指示降低的风险，则利尿应激评价可以向临床医生提供额外 的风险信息。
[0029] 因此，在第一方面，本发明涉及一种评价患者急性肾损伤进展的方法，包括：
[0030] 对获自患者的体液样品进行生物标记物测定以提供测定结果，其中所述生物标记 物测定中的所述生物标记物与急性肾损伤风险相关联；
[0031] 使所述测定结果与相对于个体预定群体风险的患者急性肾损伤风险相关联；
[0032] 利用患者的急性肾损伤风险而分类患者接受利尿应激评价的适合性；
[0033]如果患者被分类为适合的，则对患者进行所述利尿应激评价以提供呋塞米诱导的 尿排出量值;和
[0034]使所述利尿诱导的尿排出量值与急性肾损伤进展风险相关联。
[0035]适合本发明生物标记物测定组成部分的生物标记物包括但不限于选自由以下组 成的组的一种或多种生物标记物:金属蛋白酶抑制剂2、血小板反应蛋白-1、抗白细胞蛋白 酶、胰岛素样生长因子结合蛋白7、金属蛋白酶抑制剂4、金属蛋白酶抑制剂1、透明质酸、跨 膜糖蛋白NMB、卵泡抑素、肝细胞生长因子、肿瘤坏死因子受体超家族成员6、生长调节的α蛋 白、C-C基序趋化因子24、金属蛋白酶抑制剂3、C-X-C基序趋化因子6、肿瘤坏死因子受体超 家族成员11B、半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C、β-2-微球蛋白、血清白蛋白、丛生蛋白、白介素-8、 嗜中性粒细胞明胶酶相关的载脂蛋白、白介素-2受体α链、甲型肝炎病毒细胞受体1、壳多糖 酶-3样蛋白1、血清肌酐和透明质酸。该清单不意为限制性的。在优选实施方案中，本发明的 生物标记物测定组成部分可以包括测量金属蛋白酶抑制剂2和/或胰岛素样生长因子结合 蛋白7的浓度。
[0036] 除了生物标记物结果，健康状态、尤其是肾功能的其它临床指标可以包括在用于 分类患者接受利尿应激评价的适合性的方法中。此类临床指标可以包括以下一种或多种： 患者的基线尿排出量值、患者血清肌酐的基线变化、人□统计信息(例如，体重、性别、年龄、 种族）、医疗史(例如，家族史、手术类型、预先存在的疾病例如动脉瘤、充血性心力衰竭、子 痫前期、子痫、糖尿病、高血压、冠状动脉疾病、蛋白尿、肾功能不全或败血症，毒素接触类型 例如接触NSAID、环孢菌素、他克莫司、氨基糖苷类、膦甲酸、乙二醇、血红蛋白、肌红蛋白、异 环磷酰胺、重金属、甲氨蝶呤、不透射线的造影剂或链脲佐菌素）、其它临床变量(例如，血 压、体温、呼吸率）、风险评分(APACHE评分、PREDICT评分、UA/NSTEMI的ΤΙΜΙ风险评分、 Framingham风险评分、Thakar等的风险评分(J. Am. Soc .Nephrol · 16:162-68,2005)、Mehran 等的风险评分（J · Am· Col 1 · Cardiol .44:1393-99，2004)、Wijeysundera等的风险评分 (JAMA297:18(n-9,2007)、Goldstein和Chawla的风险评分（Clin. J.Am. Soc .Nephrol ·5: 943-49，2010)或Chawla等的风险评分(Kidney Inti · 68:2274-80，2005))、肾小球滤过率、 估计肾小球滤过率、尿产率、血清或血浆肌酐浓度、尿肌酐浓度、钠排泄分数、尿钠浓度、尿 肌酐与血清或血浆肌酐之比、尿比重、尿渗透压、尿液脲氮与血浆脲氮之比、血浆BUN与肌酐 之比、以尿钠八尿肌酐/血浆肌酐）计算的肾衰竭指数、血清或血浆中性粒细胞明胶酶 (NGAL)浓度、尿NGAL浓度、血清或血浆半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度、血清或血浆心肌钙蛋 白浓度、血清或血浆BNP浓度、血清或血浆NTproBNP浓度、和血清或血浆proBNP浓度。可与一 种或多种肾损伤标记物测定结果组合的其它肾功能的量度描述于下文和Harrison ' s Principles of Internal Medicine，第17版，McGraw Hill，New York，第1741-1830页，及 Current Medical Diagnosis&Treatment2008,第47版，McGraw Hill，New York，第785-815 页中，上述每个文献在此以引用的方式整体并入。仅作为例子，用于分类患者接受利尿应激 评价的适合性的方法可以包括确定患者是否经历了 6小时的少尿症，所述少尿症定义为尿 排出量〈0.51111/1^/小时、或血清肌酐升高0.31^/北或高于基线血清肌酐浓度150-200%的 增加。
[0037] 可使用各种方法来评价生物标记物结果以分类患者为适合或不适合接受利尿应 激评价。作为例子，可以选择预先确定将相关群体分成两组或多组的生物标记物的截止值。 为了方便，第一组通常称为"非患病"群体，代表具有AKI高风险的那些患者，因此未指示利 尿应激评价。第二组代表通过生物标记物结果测量AKI风险小但是可进行利尿应激评价以 改善患者管理的那些患者。第二组AKI的相对风险相对于第