基于太赫兹超材料检测微量活细菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于检测领域，具体涉及基于太赫兹超材料检测微量活细菌的方法。
【背景技术】
[0002] 传统细菌检测方法是根据细菌培养后的形态和代谢特征，进行种属的鉴定。通常 需要几天的时间来获取致病菌的种类，而某些生长较为缓慢的细菌所需要时间更长。基于 核酸放大技术的反应，例如PCR可以更加快速的鉴定出病原菌类型，但是需要复杂的核酸提 取过程和提前制备与其匹配的引物。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-T0F-MS) 可以避免核酸提取直接检测培养后的纯菌落，但灵敏度较低，灵敏度仅为10 5-106CFU。更为 重要的是，核酸放大技术和MALDI-T0F-MS分别是检测细菌的特异性核酸和蛋白，不能区分 待检细菌的生存状态，因为特异性成分可来自活菌也可来自死菌。检测到死菌对感染性疾 病诊断意义不大，并且可能导致假阳性结果的产生。因此，建立一种简便、快速的微量活细 菌的检测方法对于临床感染性疾病的诊断具有非常重要的意义。
[0003] 太赫兹（Terahertz，THz)辐射是指频率在0 · 1~ΙΟΤΗζ，波长在30~3000μπι之间的 电磁波，由于其波段位于微波和红外之间，早些年也被称为远红外射线（Far-infrared rays)。太赫兹时域光谱仪(THz-TDS，Terahertz time-domain spectroscopy)由于其较高 的信噪比、可直接获取折射率和吸收系数等优点被广泛运用生物医学研究中，包括癌症成 像、残留抗生素成分检测和蛋白质动力学研究。由于不同细菌具有的其特定结构在THz频段 下具有不同的介电响应特征，并且同种细菌的活菌和死菌具有明显的差异性光谱，为太赫 兹波用于细菌检测提供了相关理论支撑和契机。但是，大多数繁殖体细菌由于胞内水强烈 吸收的掩盖作用，并不能显示出特异性的吸收峰，吸收系数光谱为相对平滑的曲线，只能通 过数值大小进行鉴别。此外，由于太赫兹波长（ΙΤΗζ处为300μπι)和细菌大小(通常1-2μπι)存 在长度尺寸失配的问题，根据瑞利散射原理，可导致低散射截面。因此，需要寻找一种方法， 解决太赫兹波长与细菌大小不相匹配的问题。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供基于太赫兹超材料检测微量活细菌的方 法，不需要标记，能够快速检测，并且方法简单。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] 基于太赫兹超材料检测微量活细菌的方法，取菌液加至太赫兹超材料中心，烘干 后太赫兹时域光谱仪在18~25°C、检测池相对湿度低于2%条件下采用透射模式进行测量 透射光谱;所述太赫兹超材料由硅基底和硅基底上周期性排列金属开口谐振环所组成。
[0007] 优选的，所述烘干为42°C条件下烘干lOmin。
[0008] 优选的，所述菌液添加量为菌体数量至少为l〇3CFU。更优选的，取10yL菌液浓度为 105CFU/ml的菌液添加至太赫兹超材料中心。
[0009] 优选的，每个由五个金属开口谐振环组成，中间缺口大小为2~3μπι。
[0010]更优选的，所述娃基底的厚度为470μηι，所述金属开口谐振环的金属厚度为200nm。
[0011] 本发明的有益效果在于：本发明公开了基于太赫兹超材料检测微量活细菌的方 法，该方法简单，不需要标记，能够快速检测，太赫兹超材料具有多个吸收峰，因此能够实现 多种细菌鉴别，并且需要的样品量少，极大的提高检测灵敏度，检测灵敏度达到1 〇3CFU，实 现微量细菌的有效鉴别。
【附图说明】
[0012] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0013] 图1为太赫兹超材料的光学显微镜图片。
[0014] 图2为利用太赫兹超材料检测微量大肠杆菌透射光谱图。
[0015] 图3为利用太赫兹超材料检测微量大肠杆菌活菌和死菌的透射光谱图。
[0016] 图4为采用有限元分析方法模拟出的覆盖了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的透射光 谱图。
【具体实施方式】
[0017] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0018] 太赫兹超材料是制作在半导体衬底或者电介质上的亚波长金属结构组成的，具有 自然材料不具备的特异电磁特性的人工复合材料。以前的功能性超材料主要集中在操纵微 波、远红外和可见光频段，很少见超材料用于太赫兹频段的相关报道，本发明通过制备适用 于太赫兹频段的超材料，弥补超材料用于太赫兹频段空缺的机遇。
[0019] 本发明的太赫兹超材料是在硅基底上周期性排列的金属开口谐振环所组成，硅片 为470μπι厚，硅片上的金膜为200nm厚，每个周期由五个金属开口谐振环所组成，中间的缺口 大小为2_3μπι，与细菌大小尺寸相匹配(图1)。其中超材料由现有光刻技术制备。
[0020] 如果把超材料中的开口谐振环（SRR)看作为一个电感电容电路元件，超材料的共
其中L和C分别是电感和电容。电感主要是所制备 ? 超材料的几何参数所决定，而电容与电容器的有效介电常数密切相关。当细菌覆盖于超材 料表面时，有效介电常数的改变导致了电容的改变，最终导致了共振频率的位移。由于不同 细菌在太赫兹波段具有不同的介电相应特征，介电常数改变上的差异引起共振频率位移数 值上的差异，从而可用于细菌种属间的鉴别。超材料的强局域场分布和高Q值谐振使其对材 料表面的物质非常敏感，使得太赫兹超材料能用于痕量细菌的检测。此外，因为材料内间隙 的大小和细菌大小尺寸相匹配，均为微米级，太赫兹超材料适宜于细菌检测。
[0021] 利用太赫兹超材料检测微量活细菌的方法，具体步骤如下：
[0022] (1)细菌培养:将冻存的标准菌株大肠杆菌接种于哥伦比亚血琼脂平板，在温度为 37°C、C0 2体积分数为5%的恒温孵箱中培养过夜，培养后挑选无污染、形态典型的单菌落， 利用灭菌生理盐水充分润洗去除培养基成分，随后离心富集，重悬于灭菌生理盐水中，根据 吸光度(0D6QQ)和菌液中每毫升的菌落形成单位数值(cf u/mL)的标准曲线，测量吸光度，配 置成105CFU/ml的浓度；
[0023] (2)样品测量:测量高阻硅的透射光谱作为样本的参考信号，以消除硅片本身带来 F-P驻波的影响，然后分别取10yL菌液加至太赫兹超材料中心，放置于热板上在42°C条件下 烘干lOmin，然后用太赫兹时域光谱仪（THz-TDS，Terahertz time-domain spectroscopy) 在室温（18~25°C)下采用透射模式进行测量，为了避免水蒸气的强烈吸收影响检测结果， 在光路中配置有密闭装置并冲入高浓度氮气，使检测池相对湿度降至2%以下;并以测量未 加样本的太赫兹白超材料作对比，结果如图2所示。
[0024] 结果显示，大肠杆菌透射光谱与空白样本的投射光谱不同，其共振频率产生了偏 移，其原因是大肠杆菌覆盖于超材料表面时，有效介电常数的改变导致了电容的改变，最终 导致了共振频率的位移。其中偏移量为12.5GHz，表明本发明的方法能够检测10 3CFU的样 本，其灵敏度达到l〇3CFU。
[0025] 然后按照上述相同的方法检测大肠杆菌活菌和死菌，大肠杆菌死菌制备方法为在 100°C下煮沸lh，结果如图3所示。结果显示，大肠杆菌活菌和死菌的透射光谱的共振频率产 生了微量偏移。其原因是由于活菌与死菌的含水量不同，分别覆盖于超材料表面时，有效介 电常数的改变量不同导致了电容改变量不同引起的。因此，可以采用本发明的方法检测微 量死菌和活菌，不需要标记。
[0026]为了证明本发明的方法能够鉴别多种细菌，采用有限元分析方法模拟出透射光 谱，结果如图4所示。
[0027]结果显示，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的透射光谱的共振频率产生了偏移。其原 因是由于材料表面微环境的有效介电常数的改变引起电容的改变，材料的共振频率产生红 移，而不同细菌对太赫兹光谱具有不同的介电相应特征，介电常数的差异可表位为红移量 的差异。
[0028] 然后比较大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的共振频率偏移量，结果如表1所示。
[0029] 表1、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的共振频率偏移量的比较
[0031]由表1可知，Afl、Af2和Af3分别是第一、二和三个共振峰频率位移的数值。由于 实验所采取的太赫兹超材料的每个周期内具有多个SRR，材料本身具有多个共振峰，在检测 样本种类较多时更加适合，因为只需要单个峰的红移量有所差异即可将细菌区分开来，这 在检测样本种类较多时显得尤为重要。因此，利用本发明的方法能够区分不同的细菌，不需 要标记。
[0032]最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 基于太赫兹超材料检测微量活细菌的方法，其特征在于:取菌液加至太赫兹超材料 中心，烘干后利用太赫兹时域光谱仪在18~25°C、检测池相对湿度低于2%条件下采用透射 模式测量透射光谱;所述太赫兹超材料由硅基底和硅基底上周期性排列金属开口谐振环所 组成。2. 根据权利要求1所述基于太赫兹超材料检测微量活细菌的方法，其特征在于:所述烘 干为42°C条件下烘lOmin。3. 根据权利要求1所述基于太赫兹超材料检测微量活细菌的方法，其特征在于:所述菌 液添加量为菌体数量至少为l〇3CFU。4. 根据权利要求1所述基于太赫兹超材料检测微量活细菌的方法，其特征在于:每个由 五个金属开口谐振环组成，中间缺口大小为2~3μπι。5. 根据权利要求1所述基于太赫兹超材料检测微量活细菌的方法，其特征在于:所述硅 基底的厚度为470μηι，所述金属开口谐振环的金属厚度为200nm。
【专利摘要】本发明公开了基于太赫兹超材料检测微量活细菌的方法，具体方法为取菌液加至太赫兹超材料中心，烘干后利用太赫兹时域光谱仪在18～25℃、检测池相对湿度低于2％条件下采用透射模式进行测量透射光谱；其中太赫兹超材料由硅基底和硅基底上周期性排列金属开口谐振环所组成，本发明的方法能够快速、无标记检测微量活细菌。
【IPC分类】G01N21/59
【公开号】CN105588820
【申请号】CN201510939731
【发明人】杨翔, 府伟灵, 黄庆, 罗阳, 刘跃平, 余抒, 徐含青, 赵祥, 刘羽, 杨柯
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2015年12月15日