专利名称：活细菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有干燥的停滞态微生物细胞的组合物的制备方法、所述组合物及由该组合物制备的活培养物。
活培养物的贮存是本领域中公认的难题。例如，美国专利3,897,307公开了(ⅰ)使用抗坏血酸盐化合物和谷氨酸盐或天冬氨酸盐的组合物作为产乳酸细菌细胞的稳定剂；(ⅱ)使用某些糖类，特别是浓度为每亳升样品溶液25mg的肌醇，作为冰冻干燥所述细菌细胞时的低温防护剂。
Mugnier等人(Applied and Environmental Microbiology，1985，pp108-114)公开了使用多糖凝胶与某些营养物(如C1-3和C6-12化合物)组合作为冰冻干燥细菌细胞的基质。我们发现，形成凝胶的多糖在冰冻干燥时并不收缩。
Redway等人(Cryobiology，1173-79，1974)考察了作为长期存活的冰冻干燥细菌的培养基的某些单糖(浓度最高为150mg/2ml样品)和有关的化合物。
我们现已发现，如果将微生物细胞悬浮于如下所限定的某些基质中，并在某些条件下干燥，则其短期存活率提高；如果将上述干燥体系贮存起来，并在如下所限定的某些条件下再水化，则微生物细胞的长期存活率提高。
我们还进一步意外地发现，悬浮有微生物细胞的基质的收缩并不导致短期存活率差。
本发明的第一方面提供了一种稳定化的干燥组合物，该组合物含有悬浮于收缩基质中的停滞态微生物细胞。
“稳定化”是指微生物细胞的降解减少(所述降解会导致可恢复的活细胞的损失)。
“停滞态”是指细胞不进行代谢、分裂或生长(但如进行适当处理就可恢复)。
“可恢复”是指细胞处于适当条件下时(即在进行再水化和有营养源时)能够生长和分裂。
“活细胞”是指细胞处于适当条件下时(即在进行再水化和有营养源时)能够生长和分裂。
“收缩”是指(1)基质已发生收缩，孔隙度变小，使低分子量扩散物几乎不能穿透基质，例如，基质在暴露于潮湿空气中时几乎不吸水；和/或(2)基质已经历了其玻璃化转变温度(Tg)以上的温度，从而使其发生粘性流，导致表面积/体积比大大降低，并将细胞包封在低孔隙度的保护层中。
本发明的第二方面提供一种稳定化干燥组合物的制备方法，所述组合物含有悬浮于基质中的停滞态微生物细胞，所述方法包括如下步骤A.将微生物细胞与含有将衍生出基质的材料的水性组合物混合；B.在能使材料发生粘性流并使基质收缩但不会过分损伤细胞的条件下对上述混合物进行干燥。
步骤B制得的组合物优选在低于基质的Tg的温度下贮存，即，该组合物的Tg高于其预期的贮存温度。
因此，优选对步骤B制得的组合物进行进一步的干燥，即所谓“二次干燥”，以提高基质的Tg，使组合物对更宽范围的贮存条件稳定化，即可在更高的温度下贮存。
本发明的稳定化干燥组合物所包含的微生物细胞优选为细菌细胞，然而并不排除使用其他微生物细胞如真菌、酵母等的可能性。如果微生物细胞是细菌细胞，则优选为革兰氏阴性细菌细胞，但并不排除可以是革兰氏阳性细菌细胞的可能性。可以提到的这类革兰氏阴性细胞的例子有荧光假单胞菌、大肠杆菌及根际细菌等。
本发明方法的步骤A中制备的混合物中，微生物细胞的浓度为104-1013个/ml，优选1010-1011个/ml。
本发明方法的步骤A中，与微生物细胞混合的材料是多羟基化合物，例如多元醇类，如甘露醇、肌醇、山梨醇、半乳糖醇，或优选为碳水化合物，更为优选的是一种糖。
如果该材料是一种糖，那么它可以是二糖、三糖、寡糖，或优选为单糖。单糖的例子可以举出己糖，如鼠李糖、木糖、果糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖。二糖的例子可以举出麦芽糖、乳糖、海藻糖和蔗糖等。三糖的例子可以举出棉子糖。寡糖的例子可以举出麦芽糖糊精。
本发明方法的步骤A中的混合物中，所用的多羟基化合物的浓度为10-1000mg/1010个细胞，优选200-400mg/1010个细胞。对特定的多羟基化合物而言，技术人员利用简单的实验就能找出能制得收缩基质的多羟基化合物浓度。例如，我们发现肌醇的最佳浓度为约45mg/ml，它在60mg/ml以上引起大量细胞损伤，而在约25mg/ml以下则不收缩。
某些多羟基化合物在很宽的浓度范围内都具有保护性质，而某些其他多羟基化合物则在某个临界浓度以上具有有害作用，这个临界浓度可能与多羟基化合物在水性介质中的溶解度有关。
现参照附图进一步说明本发明，这些附图以举例形式说明了本发明的组合物。
附图中
图1以曲线图形式说明了在从水或0.04M MgSO4中冰冻干燥时，荧光假单胞菌的存活率随肌醇(添加物)浓度的变化。纵轴代表以ppb表示的存活率(即1E＋09＝109ppb，1E＋08＝108ppb，等等)，横轴代表每个样品中添加物的浓度(mg)。曲线图上的黑方块(■)标示硫酸镁中的肌醇，圆圈(○)则标示水中的肌醇。
图2-7以曲线图形式说明了冰冻干燥的荧光假单胞菌的存活率随一系列单糖的单糖浓度的变化。纵轴代表存活率(ppb)，以多少亿表示(即1E＋0＝10亿，5E－1＝5亿，2E－1＝2亿，等等)，横轴代表每个样品中的糖浓度(mg)。所示单糖有图2半乳糖图5 木糖图3果糖 图6 鼠李糖图4葡萄糖图7 甘露糖图8以曲线图形式说明了细胞死亡率(k1)随基质Tg的变化以及Tg随目对湿度的变化。左边的纵轴代表k1，右边的纵轴代表Tg(℃)，横轴代表相对湿度(％)。曲线图上由实线连接的黑方块标示细胞死亡率常数(k1)，由虚线连接的菱形则标示玻璃化转变温度(Tg)。
在图中，存活率以每109个原始悬浮液中的活细菌中活细菌的数目表示，即，它代表每10亿个原始活细菌中存活下来的细菌数目，以ppb存活率表示，即，109ppb等于100％存活，108ppb等于10％存活，等等。
由图1可以看出，在低肌醇浓度下，细胞存活率得以维持，而在较高浓度下，例于大于100mg/样品(等于50mg/ml)时，细胞存活率迅速下降。
由图2-7可以看出，某些单糖在低浓度下，例如小于10mg/样品(等于5mg/ml)时，能保护细胞不受损伤，而在高浓度下，例如约400mg/样品(等于130mg/ml)时，这种保护作用基本得以维持。
由图8可以看出，如果Tg降至贮存温度(由上部21-22℃处的横线表示)以下，则细胞死亡率(k1)明显提高，这说明了在贮存过程中维持玻璃态的重要性。
材料能起作用即能够收缩又不过分损伤细胞的浓度，取决于多种因素，主要包括步骤A的悬浮液中细胞的体积份额；多羟基化合物的固有玻璃化转变温度；基质的玻璃化转变温度随其中的水浓度的变化；以及基质在冰冻干燥过程中和冰冻干燥后所处的温度。
应该认识到，多羟基化合物可以起如下作用(ⅰ)在低温下作为低温防护剂，特别是在冰冻干燥过程中防止冰颗粒造成的损伤；(ⅱ)作为液体保护剂(lyo-protectant)，防止在干燥和/或贮存过程中由于失水而造成损伤；(ⅲ)在细胞恢复过程中作为营养源。
用于本发明方法的微生物细胞可以在常规生长培养基(如营养培养液或胰胨大豆培养液)中培养，可在任何方便的生长期收集，优选在静止早期收集。
例如，将某一培养物培养于合适的培养基之内或之上，例如液体或固体平板，得到所需的细胞浓度。一般用离心法分离细胞。将细胞悬浮在含有将形成基质的材料的水性组合物中，该组合物任选含有下面提到的某些其他添加物。
优选的是，从生长培养基中分离出本发明的方法中所用的微生物细胞，将其再悬浮于含多羟基化合物、合适的添加物等的溶液中，并进行干燥，但并不排除将多羟基化合物和合适的添加物加到生长培养基中的细胞中并干燥所得混合物的可能性。
如果重新悬浮微生物细胞，则最好重新悬浮在合适的水性介质中，例如含有多羟基化合物的MgSO4溶液或优选为水。
本发明方法的步骤B中的干燥可通过蒸发、真空干燥、喷雾干燥、空气干燥等来进行，优选冰冻干燥。
如上所述，重要的是至少在干燥步骤即步骤B或任何后续步骤中达到粘性流。
步骤B中制备的干燥组合物的含水量一般低于15％w/w。
如果步骤B中的干燥包括冰冻干燥，则组合物中一般含有一种或更多种合适的添加物。可以举出的合适添加物的例子主要有低温防护剂，例如糖类或聚合物，如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；液体保护剂，例如糖类或聚合物，如聚乙烯醇、聚乙二醇；或优选为抗氧剂或所谓的增效剂，如抗坏血酸盐或谷氨酸盐，但并不排除存在其他添加物的可能性，例如所谓的填充剂，例如结晶糖类，如甘露醇；以及渗透压调节剂，如甜菜碱、脲/三甲胺-N-氧化物、脯氨酸、肌氨酸。
现参照下列实施例进一步说明本发明。
实施例1-6这些实施例说明基质中含鼠李糖的本发明组合物。
在标准培养基(双强度营养液)中培养荧光假单胞菌，并在静止早期用离心法进行收集。将细胞浓缩液再悬浮于无菌水中，并加入足量的经高温灭菌的鼠李糖浓溶液，得到约200个装在容量为5ml的冰冻干燥瓶中的等份试样，总体积为4ml，终浓度为200mg糖/2×1010个细胞。
将冰冻干燥瓶放到冰冻干燥器的控温架上，并将架温调至-30℃，从而使瓶中的内容物冰冻并使其温度在2小时内降至-28℃至-30℃。抽真空并进行48小时的初步干燥。将架温升至0℃，并令二次干燥进行24小时。将瓶温调至室温并在真空下密封，然后从冰冻干燥器中取出。
将各瓶于4℃下贮存于真空(实施例1)或于21℃下贮存于控湿空气中(实施例2-6)。
将样品在无菌水中再水化，通过在水中连续稀释继而在金氏(King’s)B生长培养基上培养，测定活细菌细胞数。利用最高稀释度平板上菌落形成单位(cfu)的数目，计算出在冰冻干燥和贮存后每单位体积存活的细菌细胞数。
冰冻干燥刚刚结束后细胞存活率为3×108ppb。
由4℃下真空贮存的细菌得到的结果示于表1。
表1
ND未测CT1为不含鼠李糖的对比试验。
从表1可以看出，鼠李糖基质的存在大大提高了细菌的存活率。
由在21℃下贮存于控湿室中的细菌得到的结果示于表2。
由表2可以看出，即使在低相对湿度下，即实施例2与CT2相比较，糖的存在也大大提高了存活率。
实施例7-10这些实施例说明基质中含鼠李糖和硫酸镁的本发明组合物。
重复实施例1-6的步骤，但将细胞浓缩液再悬浮于0.04M硫酸镁而非无菌水中，然后再加入鼠李糖溶液。
冰冻干燥刚刚结束后细胞存活率为5×108。
将冰冻干燥细胞于表3所示的温度下贮存表3所示的时间。
表3
由表3可以看出，该制剂在一定范围的温度内能提供实质性的保护作用。
实施例11-15这些实施例说明基质中含有抗坏血酸钠和谷氨酸钠的本发明组合物。
重复实施例1-6的步骤，所不同的是，在再悬浮于水和鼠李糖中的细胞中加入浓抗坏血酸钠和谷氨酸钠水溶液。
冰冻干燥刚刚结束后细胞存活率为2×108ppb。
样品于21℃下贮存于湿空气中。
表4
由表4中的实施例11和12可以看出，在低于基质Tg的温度下贮存干燥细胞，能使细胞长期稳定。
结果表明，玻璃态的收缩基质与所含的抗氧剂组合使基质能使活细胞在较为严酷的环境下长期稳定。
实施例16用离心法从培养基中分离出含有5×1012个活细胞的4g荧光假单胞菌细胞沉淀，将其与14g商业级麦芽糖糊精(Glucidex IT19)和1.6g抗坏血酸钠混合，将该材料在初始为室温下减压干燥，其中所蒸发出的水冷凝到维持在-50℃的冰阱上。
约18小时后停止干燥，此时真空度为1毫巴左右。
样品经用纯水再水化并在营养琼脂上培养后，活细胞恢复率一般为50-90％。
该方法制得的材料以收缩无定形基质的形式存在，其玻璃化转变温度超过20℃(当样品处于标准实验室相对湿度时)。
权利要求
1.一种稳定化干燥组合物，该组合物包含悬浮于收缩基质中的停滞态微生物细胞。
2.权利要求1的组合物，其中所述微生物细胞是细菌细胞。
3.权利要求2的组合物，其中所述细菌细胞是革兰氏阴性细菌细胞。
4.权利要求3的组合物，其中所述革兰氏阴性细胞是荧光假单胞菌、大肠杆菌或根际细菌。
5.一种制备稳定化干燥组合物的方法，所述组合物含有悬浮于基质中的停滞态微生物细胞，所述方法包括如下步骤A.将微生物细胞与含有将衍生出基质的材料的水性组合物混合；B.在能使材料发生粘性流并使基质收缩但不会过分损伤细胞的条件下对上述混合物进行干燥。
6.权利要求5的方法，其中对步骤B制得的组合物进行进一步的干燥，以提高基质的玻璃化转变温度，使组合物对更宽范围的贮存条件稳定化。
7.权利要求5的方法，其中步骤A中制得的混合物中微生物细胞的浓度为104-1013个/ml。
8.权利要求7的方法，其中细胞浓度为1010-1011个/ml。
9.权利要求5的方法，其中该方法的步骤A中与微生物细胞混合的材料是多羟基化合物。
10.权利要求9的方法，其中多羟基化合物为单糖。
11.权利要求9的方法，其中步骤A的混合物中所用的多羟基化合物的浓度为10-1000mg/1010个细胞。
12.权利要求11的方法，其中多羟基化合物的浓度为200-400mg/1010个细胞。
13.按权利要求5制备的组合物，该组合物的玻璃化转变温度高于其预期的贮存温度。
全文摘要
将微生物细胞稳定化，以便以干燥组合物的形式以悬浮在收缩基质中的停滞态贮存。该组合物的制备方法是将微生物细胞如革兰氏阴性细菌细胞(例如荧光假单胞菌)与一种含有将衍生出基质的多羟基化合物(优选糖类)的水性组合物混合物，并在能使多羟基化合物发生粘性流并使基质收缩但不过分损伤细胞的条件下干燥上述混合物。基质的玻璃化转变温度最好高于组合物的贮存温度。
文档编号C12N11/00GK1121731SQ9419190
公开日1996年5月1日 申请日期1994年4月18日 优先权日1993年4月28日
发明者D·K·罗德汉姆, J·B·坎特韦尔 申请人:曾尼卡有限公司