地衣芽孢杆菌在促进蓝莓组培苗生根或生长中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了地衣芽孢杆菌在促进蓝莓组培苗生根或生长中的应用，所述的应用包括：直接以整肠生为原料，经细菌活化后，以地衣芽孢杆菌菌液的形式接种在蓝莓继代苗上，省去了大量分离、纯化、鉴定菌株的步骤，也没有添加任何外源激素，成本低廉，操作简单，安全无毒，效果明显；接种后的蓝莓组培苗生根率显著提高，株高、叶面积等指标也得到改善，并且真菌污染后成活率也大幅度提高，显著提高了蓝莓组培苗的生根质量。
【专利说明】地衣芽孢杆菌在促进蓝莓组培苗生根或生长中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及地衣芽孢杆菌的应用，尤其涉及地衣芽孢杆菌在促进植物组培苗生根或生长中的应用，属于地衣芽孢杆菌的应用领域。
【背景技术】
[0002]蓝莓(Semen Trigonellae)具有软化人体血管、增强免疫机能等保健效用，被誉为“水果之王”，亦被联合国粮农组织列为人类五大健康食品之一，市场价格昂贵。就目前而言，蓝莓产量远远满足不了国内的需求，且蓝莓的各种加工产品在国际市场深受欢迎。但由于其材料来源有限，繁殖系数低，无法实现规模化生产，组织培养是解决这一问题的重要途径。然而常规方法扩繁推广慢，蓝莓试管苗生根困难、生根率低、发根周期长，制约了优良品种的产业化育苗进程。
【发明内容】
[0003]为了克服上述现有技术存在的问题，本发明的目的是提供地衣芽孢杆菌在促进蓝莓组培苗生根或生长中的应用。
[0004]所述应用是在蓝莓继代苗上接种地衣芽孢杆菌，进行无糖组织培养。
[0005]特别是，所述地衣芽孢杆菌是以整肠生为原料，经细菌活化处理后，以地衣芽孢杆菌菌液的形式接种在蓝莓继代苗上。 [0006]尤其是，所述细菌活化处理包括以下步骤:
[0007]将地衣芽孢杆菌干粉，接种于液体培养基后，进行第一次振荡，振荡时间为2-3小时，设定温度为30°C，转速为180转/分；
[0008]将完成第一次振荡的菌液接种到固体培养基上，在28°C的恒温培养箱内培养48小时，取单菌落于液体培养基中，进行第二次振荡，振荡时间为8小时，设定温度为30°C，转速为180转/分；
[0009]将完成第二次振荡的菌液进行离心处理，弃掉上清液，在_20°C的温度下，用浓度为10%的甘油冻存。
[0010]其中，所述的液体培养基和固体培养基均为LB培养基。
[0011]LB液体培养基的配方为:酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，ρΗ6.8-7.2ο
[0012]LB固体培养基的配方为:酵母提取物5g/L,胰蛋白胨IOg g/L,氯化钠10gg/L,琼脂 17-20g g/L, ρΗ6.8-7.2。
[0013]特别是，所述地衣芽孢杆菌菌液的浓度为lOOOOOcfu/ml。
[0014]尤其是，所述在蓝莓继代苗上接种地衣芽孢杆菌包括将切割好的蓝莓继代苗浸泡于所述地衣芽孢杆菌菌液中，浸泡处理5min。
[0015]特别是，所述无糖组织培养包括:将接种地衣芽孢杆菌的蓝莓继代苗插入蓝莓无糖组织培养基中，进行组织培养。[0016]尤其是，所述蓝莓无糖组织培养基的配方为:硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，硝酸二氢钾170mg/L,硫酸镁370mg/L,氯化钙440mg/L,碘化钾0.83mg/L,硼酸6.2mg/L,硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，镍酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.25mg/L，氯化钴0.025mg/L,乙二胺四乙酸二钠37.25mg/L，硫酸亚铁27.85mg/L,盐酸硫胺素lmg/L，琼脂6g/L，pH=5.8。
[0017]本发明与现有技术相比，具有以下有益结果:
[0018]本发明首次将地衣芽孢杆菌应用于促进无糖组织培养的蓝莓的生根环节，使蓝莓组培苗的生根率显著提高；
[0019]本发明所使用的地衣芽孢杆菌直接以整肠生为原料，经细菌活化后，以地衣芽孢杆菌菌液的形式接种在蓝莓继代苗上，省去了大量分离、纯化、鉴定菌株的步骤，也没有添加任何外源激素，成本低廉，操作简单，安全无毒，效果明显。
[0020]按照本发明所述的技术方案处理的蓝莓组培苗，株高、叶面积等其他指标也得到改善，并且真菌污染后成活率也大幅度提高，显著提高了蓝莓组培苗的生根质量。
【具体实施方式】
[0021]下面通过【具体实施方式】来进一步描述本发明所述技术方案的有益效果，这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的配方思路、用途范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0022]下述实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0023]下述实施例中的百分含量，如无特殊说明，均为百分含量。
[0024]下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025]预备实施例1地衣芽孢杆菌菌液的制备
[0026]I)打开整肠生(即地衣芽孢杆菌胶囊，生产厂家:东北制药集团沈阳第一制药有限公司)的胶囊外壳，用接种环蘸取其中的地衣芽孢杆菌干粉，接种于装有LB液体培养基的锥形瓶中，放入摇床进行第一次振荡，振荡时间为2-3小时，设定温度为30°C，转速为180转/分。
[0027]其中，所述LB液体培养基的配方为:酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L, pH6.8-7.2。
[0028]2)第一次振荡完成后，用接种环蘸取菌液，均匀划线接种到LB固体培养基上，在280C的恒温培养箱内培养48小时，取单菌落于装有LB液体培养基的锥形瓶中，放入摇床进行第二次振荡，振荡时间为8小时，设定温度为30°C，转速为180转/分。
[0029]其中，所述LB固体培养基的配方为:酵母提取物5g/L，胰蛋白胨IOg g/L，氯化钠IOg g/L，琼脂 17-20g g/L，pH6.8-7.2。
[0030]3)第二次振荡完成后，对菌液进行离心处理，弃掉上清液，在_20°C的温度下，用浓度为10%的甘油冻存剩余膏状物，制成地衣芽孢杆菌菌液，备用。
[0031]实施例1地衣芽孢杆菌在促进蓝莓组培苗生根或生长中的应用
[0032]1.接种:
[0033]在直径35mm的培养皿内，将预备实施例1制成的地衣芽孢杆菌菌液用无菌去离子水稀释至其中地衣芽孢杆菌的浓度为lOOOOOcfu/ml ；[0034]将切割好的蓝莓继代苗(2_3cm)浸泡于上述培养皿中，浸泡处理5min ；
[0035]2组织培养:
[0036]将浸泡处理后的蓝莓继代苗插入蓝莓无糖组织培养基中，进行组织培养，培养时间为8周，得到蓝莓组培苗。
[0037]其中，所述蓝莓无糖组织培养基的配方为:硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，硝酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰 22.3mg/L，硫酸锌 8.6mg/L，镍酸钠 0.25mg/L，硫酸铜 0.25mg/L，氯化钴 0.025mg/L,乙二胺四乙酸二钠37.25mg/L，硫酸亚铁27.85mg/L,盐酸硫胺素lmg/L，琼脂6g/L，pH=5.8。
[0038]对照实施例1
[0039]取与实施例1中生长状况一致的蓝莓继代苗(2-3cm)浸泡于无菌去离子水中5分钟(与实施例1中稀释的地衣芽孢杆菌菌液同体积)，然后接种于蓝莓无糖组织培养基中，进行组织培养，培养时间为8周，得到蓝莓组培苗。
[0040]试验例I生长和生根指标测定
[0041]1.1测定方法:
[0042]取实施例1和对照例I所述蓝莓组培苗各30棵，自培养第3周开始，观察其生根情况并计算生根率；培养八周后，开始测量株高、叶面积、根长和根数四项生长指标，并基于以上指标，评价蓝莓组培苗的生根质量。 [0043]重复三次实验，取平均数，并计算标准误。
[0044]生根率=已生根的蓝莓组培苗的个数/蓝莓组培苗总数X 100% ；
[0045]生根质量Q=生根率(第八周)X 50%+根数X 25%+根长X 25%。
[0046]1.2测定结果:
[0047]1.2.1 生根率
[0048]对实施例1和对照例I所述蓝莓组培苗的生根率进行观察和计算，结果如表1所示。
[0049]表1不同蓝莓组培苗的生根率
【权利要求】
1.地衣芽孢杆菌在促进蓝莓组培苗生根或生长中的应用。
2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于:将蓝莓继代苗接种地衣芽孢杆菌后进行组织培养。
3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于:将地衣芽孢杆菌种经细菌活化处理后，以地衣芽孢杆菌菌液的形式接种在蓝莓继代苗上。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述细菌活化处理包括以下步骤: 将地衣芽孢杆菌干粉，接种于液体培养基后，进行第一次振荡，振荡时间为2-3小时，温度为30°C，转速为180转/分； 将完成第一次振荡的菌液接种到固体培养基上，在28°C的恒温培养箱内培养48小时，取单菌落于液体培养基中，进行第二次振荡，振荡时间为8小时，设定温度为30°C，转速为180转/分； 将完成第二次振荡的菌液进行离心处理，弃掉上清液，在_20°C的温度下，用浓度为10%的甘油冻存。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌菌液的浓度为100000cfu/ml。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述的接种包括将切割好的蓝莓继代苗浸泡于地衣芽孢杆菌菌液中，浸泡处理5min。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述组织培养是无糖组织培养。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述无糖组织培养采用的培养基的配方为:硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，硝酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化?丐440mg/L,碘化钾0.83mg/L,硼酸6.2mg/L,硫酸猛22.3mg/L,硫酸锌8.6mg/L,镍酸钠0.25mg/L,硫酸铜0.25mg/L,氯化钴0.025mg/L,乙二胺四乙酸二钠37.25mg/L,硫酸亚铁27.85mg/L,盐酸硫胺素 lmg/L，琼脂 6g/L，pH=5.8。
【文档编号】A01H4/00GK103828721SQ201410105267
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月20日 优先权日:2014年3月20日
【发明者】姬谦龙, 贾士乾, 王贵禧, 韩素英, 刘悦萍, 于涌鲲, 张乔丽 申请人:北京农学院