基于脂肪酸碳稳定同位素的水产品产地溯源方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基于脂肪酸碳稳定同位素的水产品产地溯源方法，属于食品安全领 域，主要用于对水产品的真实产地进行识别和溯源。
【背景技术】
[0002] 我国是水产养殖大国，水产养殖产量约占全球总产量的80%以上，稳居世界首位。 但是，食品安全问题一直阻碍着产业的发展和升级。水产品质量追溯体系建设有助于解决 水产品的掺假售假问题，能够切实维护水产品生产企业、养殖户和广大消费者的切身利益。 近几年，我国在水产品质量追溯方面相继实施了从养殖、加工到流通等环节的标识化管理， 将物联网、二维码、RFID等信息产业技术应用于原产地认证和生产、加工、流通、检测、物流 等各个环节，建立了从"鱼塘"到餐桌的全程可追溯的水产品质量安全检测系统，在水产品 质量溯源技术和溯源平台建设方面已经取得了从无到有的巨大进步。但这些技术尚有一定 缺陷，仅从水产品体表或产品外包装标志上做"表面文章"，长此以往，随着不法分子造假技 术的提高，这些"表面文章"迟早会被攻破。因此，通过由生物自身的特性和生物与其特有生 境的关系组成的水产品特有的"指纹"信息建立的指纹溯源技术已成为高精准溯源技术的 发展方向。
[0003] 稳定同位素作为生物自身组成物质，带有明显的生物特性。稳定同位素技术应用 于农产品的产地溯源已得到了广泛的研究，但是，对生物全样进行稳定同位素检测具有局 限性，会受到很多因素的影响，例如生物的不同生长阶段物质组成不同、对不同化合物的吸 收转化效率差异及同位素分馏等。脂肪酸、碳水化合物、氨基酸等特征化合物在生物体的新 称代谢过程不同，而具有不同的稳定同位素特征，这些物质含量不同会导致稳定同位素检 测结果产生偏差。
[0004] 生物体脂肪酸主要来源于摄食食物，因而带有明显的地理信息，可以作为生物标 志物来区分生物的不同地域来源。首先，生物对脂肪酸的合成和改造能力具有差异性。生物 能够对脂肪酸进行合成、修饰碳链长度及引入双键的改造，但是改造能力具有差异性，通常 随着生物等级的提高，能力逐渐降低，脊椎动物几乎丧失这种能力。其次，脂肪酸在代谢过 程中具有保守性。脂肪被消化后释放出脂肪酸，脂肪酸不会被分解，而是以原来的形式被生 物吸收。第三，脂肪酸具有可保存性。脂肪酸合成的脂肪能在生物体内以能量形式储存。这 为利用脂肪酸中的碳稳定同位素作为指标对水产品的产地进行识别和溯源提供了理论依 据。
【发明内容】
[0005] 为了克服传统稳定同位素技术上的缺陷，本发明利用脂肪酸作为区分不同地域的 生物标志物，通过对单一化合物脂肪酸的碳稳定同位素进行检测和分析，应用于对水产品 的产地进行识别和溯源，能够使鉴定结果更加准确、可靠。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:基于脂肪酸碳稳定同位素的水产品 产地溯源方法，包括以下步骤：
[0007] A、前处理:将收集到的水产品（如海参)去肠，留取肌肉部分，-20 °C冷冻完全，盛放 于无稳定同位素干扰的器具中进行冷冻干燥，再用无稳定同位素干扰的器具将干燥样品研 磨成粉末状；
[0008] 所述无稳定同位素干扰的器具为由玻璃或陶瓷材质的器具；所述冷冻干燥温度 为-60~-50 °C，冷冻干燥时间以样品完全干燥为止；
[0009] B、总脂提取：总脂提取方法参照改进的Folch法，取样品5.0g，加入100ml氯仿-甲 醇（2:1，v/v)溶液，37 °C振荡抽提30min后浸提过夜，过滤，抽提液用1/5体积的0.88 %氯化 钠溶液洗涤，静置分层，收集氯仿层，经无水硫酸钠干燥后，通过氮吹法浓缩获得样品总脂；
[0010] 所述的Folch法为国际通用的脂类提取法;所述样品为水产品的干燥磨细样品；
[0011] C、脂肪酸甲酯化：对总脂的脂肪酸甲酯化采用1 %硫酸-甲醇甲酯化法，取总脂 20mg，加入lml 1 %硫酸-甲醇溶液，于60 °C水浴甲酯化60mi η，冷却后加入正己烧lml振荡 30s，静置分层，取上清液放入样品瓶中4°C冷藏保存；
[0012] D、脂肪酸C稳定同位素测定:脂肪酸甲酯样品经气相色谱质谱联用仪(GC-MS)进行 分析鉴定，同时，经稳定同位素比质谱仪(IRMS)测定单分子脂肪酸的δ13(：值。稳定C同位素的 自然丰度表不为：
[0013] 5X=([R 样品/R 标准]-1)Χ1〇3
[0014] 式中：χ代表13c;r代表13c/12c』13c值是相对于标准的自然丰度。分析精度:S 13c <0.20%〇。
[0015] 所述的气相色谱仪为Trace GC Ultra，Thermo_Fisher;所述的质谱仪为ISQ， Thermo-Fisher;所述的稳定同位素比质谱仪为Delta V Advantage Isotope Ratio MS， Thermo-Fisher；
[0016] E、结果分析：对所获得的脂肪酸甲酯样品的GC保留时间和MS谱图与Supe lc〇37-FAME混标的GC保留时间和MS谱图的标准谱库(NIST2008)相比较，确定脂肪酸种类。同时，结 合IRMS所测得的脂肪酸的δ13(：值，确定各脂肪酸组成的δ13(：值。通过比较不同海域样品间的 脂肪酸的S 13C值，找出δ13(：值差异显著的脂肪酸种类，对差异最为显著的某种或者某些脂肪 酸作为指标建立不同海域不同种类水产品的S 13C值指纹库，用于鉴别不同海域不同种类的 水广品。
[0017] 本发明步骤D中所使用的各仪器的工作参数为：
[0018] (1)气相色谱仪:DB-5 (30m X 0 · 25mm X 0 · 25μπι)色谱柱。升温程序:初始温度70 °C， 保持lmin;以8°C/min的速度升至170°C，保持6min;再以4°C/min升至280°C保持5min;载气： 高纯He，纯度2 99.999 %，流速1.2mL/min恒流模式;进样口温度280 °C ;进样方式为无分流 进样;进样量:1. 〇yL。
[0019] (2)质谱仪:传输线温度:250°C ;离子源温度:230°C ;电离方式:EI电子能量70eV。
[0020] (3)稳定同位素比质谱仪:分析柱温度为45°C，用USGS24即δ13〇? = -16.00%。标定 c〇2钢瓶，用标定的钢瓶作为标准。
[0021] 本发明的一个优选方案是:所述的冷冻干燥温度为-50°C，冷冻干燥时间为24h。
[0022] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0023] (1)现有稳定同位素技术选取的是肌肉全样，成分复杂，且各物质含量随生物的不 同生长阶段和季节变化差异显著，使得鉴定结果不够准确。本发明应用脂肪酸单分子S13c值 作为鉴别指标，成分单一，能够使鉴定结果更加准确、可靠。
[0024] (2)现有的水产品产地溯源技术包括脂肪酸组成分析，通过不同地区之间样品的 脂肪酸含量差异来对水产品进行产地鉴别，但是生物的脂肪酸含量个体差异明显，且随季 节的变化存在显著差异，使得鉴定结果不准确。脂肪酸作为生物组成大分子，主要来源于摄 食食物，其C稳定同位素值主要受生存环境的影响，带有明显的地理信息，影响因素少，因 此，本发明的鉴定结果能更准确地反映生物的原产地信息，达到准确溯源的目的。
【附图说明】
[0025]图1是本发明的流程图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。 [0